k****o
发帖数: 728 | 1 请教一下，准备买Thermo的一种agarose beads，"NHS-activated agarose is
crosslinked, 6% beaded agarose resin with a particle size of 45 - 165 um”。
这里6% beaded是什么意思？crosslinked是什么crosslinked?
多谢！ |
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k****o
发帖数: 728 | 2 准备买个NHS-activated agarose beads,指标说NHS-activated agarose is
crosslinked, 6% beaded agarose resin，这里的6%是什么意思？crosslinked是说什
么和什么crosslinked？
多谢！ |
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v********n
发帖数: 91 | 3 Hello, everyone:
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$400/kg for 1-2 kg plus shipping and handling
$250/500g plus |
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v********n
发帖数: 91 | 4 Hello, everyone:
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v********n
发帖数: 91 | 5 Hello, everyone:
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b**********8
发帖数: 349 | 6 最近做ChIP,按照Upstate公司Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay Kit（
Cat No.17-295）的protocol，需要用到protein A Agarose/ Salmon sperm DNA，每个
reaction先后需要75和60ul,我每次买的那种只有2.5ml的规格， (Cat.# 16-157) 需要
300多刀，大概只能做两次ChIP,感觉用的太快了，好浪费。有人用过这个么？有没有可
能减半量使用？另外，Salmon Sperm DNA /Protein A Agarose-50% Slurry
是什么意思？ |
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q****2
发帖数: 208 | 7 按我得经验 减半没啥问题 或者你可以单独再去买Salmon Sperm DNA /Protein A
Agarose beads。
Salmon Sperm DNA /Protein A Agarose-50% Slurry就是50％的beads 50％ buffer（
其中包含了一定浓度的Salmon Sperm DNA） |
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f******p
发帖数: 178 | 8 实验室一直都是用一个hybridization oven （没有中间的转子）来给liquid agarose
保温的。这样方便制胶。上周它坏掉了，修的话很贵，不划算。现在想买一个新的oven
来给liquid agarose保温。再买一个hybridization oven用于此太浪费。不知道有没
有只有保温功能的，便宜一点的？请问大家实验室都用什么？ |
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h*****b
发帖数: 492 | 9 请问板上有人对 用alkaline agarose gel 分 P32 label的DNA 有经验的吗？
电压和平常的agarose gel 一样吗？还有大家在 dry 这种gel的时候和其它PAGE gel有
区别吗？
谢谢 |
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v********n
发帖数: 91 | 10 I just started a small Biotech startup in the USA. I have a large amount of
high-quality (Made in USA), but cheap Agarose (Molecular Biology Grade) for
sale. Similar or same products from Sigma or Invitrogen are 858 or 580
dollars per 500g, respectively. The price is 350 dollars/KG with the minimum
purchase of 2 KG. If you are interested, please let me know. Thanks. |
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l******e
发帖数: 62 | 11 I am interested in agarose wholesale. Please check your email. Thanks.
of
for
minimum |
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m**********d
发帖数: 137 | 12 不加antibody，只加ProteinA agarose孵育1hr，作为Negative Ctrl。qPCR的结果Neg
Ctrl是实验组的1/7-1/10，请问这个强度的background能否接受？
现在做的是RNAPol2的ChIP，大家都说RNApol2的这个antibody做ChIP很不错，但我步步
按照Millipore ChIP Kit做下来，elution之后用nanodrop测了一下DNA浓度，发现特低
。请问版上ChIP大牛们，要想得到个decent qPCR结果，ChIP下来的DNA浓度有个限制么？
多谢各位指点啦 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 13 我们实验室用Thermo Scitific的Glutathione Agarose纯化GST-tag蛋白
他们的手册上说用Tris buffer
想问问看有没有人用过别的buffer
比如HEPES，phosphate，Bicine之类的？
打电话去tech support已经下班了：（ |
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C*******e
发帖数: 4348 | 14 呃。。。。怎么说呢
我已经说了以前一直用Tris Buffer
这次不能用
因为要用阳离子交换柱，Tris有干扰
跟你说的crosslink有干扰相似又不尽然
（只有做primary amine基团的crosslinking才不能用Tris，crosslink不限于光做
primary
amine基团）
另外Glutathione Agarose不止sigma和GE两家
就像我原帖说的
我用的Thermo的(原Pierce)
Tris
buffer 有干扰 |
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t****g
发帖数: 120 | 15 agarose或者agar(for soft agar assay) 凝胶之后用微波炉加热又溶，这样可以反复
多少次？ 会影响什么性质之类的吗？ |
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k****l
发帖数: 279 | 16 I always reuse agarose gels several times before discarding them |
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s********n
发帖数: 342 | 17 同学们一般用哪里的琼脂糖（agarose）呀？最好能跑RNA的，
价廉又物美的，谢谢推荐！ |
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s******s
发帖数: 1584 | 18 啊对的。但是我没有比较过pull down efficiency, 就是同样多的magnetic beads 跟
flag conjugated agarose哪一个pull down 更多。但是杂带肯定是magnetic beads少
很多。 |
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m**i
发帖数: 47 | 19 alkaline agarose gel我一般都用0.6%的，所以特别fragile，电压一般20V左右，跑
overnight。电压太大，胶就化了。dry之前在7%TCA里泡30min，然后再dry。找个
protocol看看就知道了，也没什么特别特殊的。 |
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g*****1
发帖数: 78 | 20 怀孕4周到5周的时候，不知道怀孕，配了两次agarose胶。好害怕。我没有在通风橱里
加那个高浓度的EB stock，就是在实验台上随便加了一下。然后溶胶的那个瓶子也是反
复使用的，我每次用完都把瓶子倒过来放，让胶尽量流出，不过里面可能有少量残胶。
我有等胶比较凉的时候再加EB进去，也有戴手套。问了实验室的人，都说‘extremely
toxic'。现在正是致畸敏感期，每天想到这个难过的想哭。害怕生出一个有缺陷的孩子
。觉得是自己不注意造成的，对不起孩子，老公，父母。 |
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J***A
发帖数: 1511 | 21 胎儿就前几个月比较娇气， 可以请一点假， 四个月以后就好了。
怀孕4周到5周的时候，不知道怀孕，配了两次agarose胶。好害怕。我没有在通风橱里
加那个高浓度的EB stock，就是在实验台上随便加了一下。然后溶胶的那个瓶子也是反
复使用的........ |
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d*********1
发帖数: 647 | 22 lz你怀孕了还是去宝宝版发帖吧
怀孕4周到5周的时候，不知道怀孕，配了两次agarose胶。好害怕。我没有在通风橱里
加那个高浓度的EB stock，就是在实验台上随便加了一下。然后溶胶的那个瓶子也是反
复使用的........ |
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x*****7
发帖数: 7326 | 23 我过去谈的是特工用的电磁波武器，并不一定是微波波段。
至于平时热菜用的微波炉，我觉得的确不是很理想：
1）加热不是很均匀。
2）我在国内时测过微波炉向外的辐射，离微波炉五米远还可以测到相当大的RF。那个
时候我的座位离组里公用微波炉仅有一米远，每次同事来热饭菜，我都找机会走开。
3）我在国内时组里另外有台微波炉专门用来准备分子生物学实验，就是加热融化琼脂
糖（agarose)，然后加入溴化乙锭(EB)，是一种荧光试剂，同时也是强致癌物。有一次
，有同事在用那台微波炉，而另一位同事也想融化已经加了EB的agarose，这位同事素
来以大胆著称，他不愿意等待，就径直走到我身旁那台热饭菜的微波炉边，不顾我的抗
议，开始融化他的黄橙橙的加了EB的agarose。他走后，我戴上手套仔细地擦干净了热
饭菜的微波炉，但从此我不再用它热饭菜，我都是跑到同学组里热饭菜。 |
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r****o
发帖数: 105 | 24 本文献给YL
（十八）凝集素层析
我们用去垢剂溶解了膜蛋白之后，紧跟着的一步就是用Wheat Germ
Aglutinin(WGA) agarose来部分纯化insulin receptor。WGA是凝集素
(Lectin）中的一种，而Lectin指的是可以与糖基结合的蛋白质。现在常用
来做蛋白质纯化的凝集素绝大部分是从植物中提取出来的。绝大部分膜蛋
白的extracellular domain和分泌蛋白都有N-linked glycan 的糖基修饰。
根据这个性质，用固定有适当的凝集素的beads，比如WGA agarose或
者ConA agarose可以部分提纯膜蛋白。注意，只能是部分提纯，凝集素
层析并不能一步登天，让蛋白质比活力一下子提高上千倍，至多几十倍就
已经很不错了。但尽管如此，凝集素层析是一种很好的办法，因为buffer
条件非常温和，洗脱液是加了糖的buffer，透析什么的也方便，非常非常
适合于和其他层析方法偶连起来用。
纯化膜蛋白用的最主要的两种凝集素是WGA和ConA。谈到这里，
我先向大家介绍一下N-linked glycans。N |
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d********r
发帖数: 3279 | 25 Arsenic-associated bacteria (NASA's claims)
ResearchBlogging.org
Wolfe-Simon F, Blum JS, Kulp TR, Gordon GW, Hoeft SE, Pett-Ridge J, Stolz JF
, Webb SM, Weber PK, Davies PC, Anbar AD, & Oremland RS (2010). A Bacterium
That Can Grow by Using Arsenic Instead of Phosphorus. Science (New York, N.Y
.) PMID: 21127214
Note to new readers: I wrote this post on Saturday Dec. 4, mainly to
clarify my own thinking. I didn't expect anyone other than a few
researchers to ever read it. Since then I've made ... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 26 COLD-PCR then Agarose Gel electrophoresis
Abstract
The detection of low-abundance DNA variants or mutations is of particular interest to medical diagnostics,
individualized patient treatment and cancer prognosis; however, detection sensitivity for low-abundance
variants is a pronounced limitation of most currently available molecular assays. We have recently
developed coamplification at lower denaturation temperature-PCR (COLD-PCR) to resolve this limitation.
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles... 阅读全帖 |
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m*********r
发帖数: 49 | 27 正在纯化一个his-tag的蛋白。我想让蛋白结合到Ni柱上后用TEV protease剪切后收集
切下来的蛋白，我觉得这样比用immidazole洗脱纯度高，还省了以后再切tag的麻烦。
现在问题是，老板买了个qiagen的fast start kit (gravity flow的那种）， 里面的
Ni-agarose成型了之后像gel一样，不能被重新悬浮，我在加TEV protease洗脱的时候
（4C 过夜），溶液不能完全浸没Ni-agarose，跑胶后和immidazole洗脱的比较发现洗
脱效率很低，我怀疑是因为TEV protease不能很好地与Ni-agarose接触造成的。
请教下有什么推荐的解决方法么？别家卖的Ni-NT好像有那种纯化过程中一直都自由悬
浮的，
不知道哪家的好，或者我的TEV proteasejianqie剪切加洗脱的方案有设么可以改进的
地方？多谢！ |
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h*********o
发帖数: 19006 | 28 最近在用Co-IP的方法检测细菌细胞内的蛋白磷酸化水平（32P标记）。最后洗完Protei
n-A agarose后，加2 X SDS上样缓冲液，如果直接吸一是太粘吸不出来，另外这样的缓
冲液里也没蛋白信号（文献上说37度处理5 min，试过不行，难道beads用的不一样？）
。
如果100度煮5 min倒是能把蛋白从protein-A agarose上分离下来，但预实验表明100度
处理大概会使50%的磷酸化蛋白信号消失。请问做体内蛋白磷酸化检测的朋友，还有别的
什么着数可以用吗？ |
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y******y
发帖数: 107 | 29 想要在一个plasmid A里面加上一个基因的ORF。首先把这个基因用PCR给扩增出来（PCR
两个末端带有特定酶切位点序列 Nhe I和Age I，通过引物加进去的），然后连到pGEM
－T plasmid里面，transform之后筛选。然后用Nhe I和Age I酶切，agarose gel 切胶
纯化这段基因片断。
把plasmid A也用Nhe I和Age I酶切，同样的agarose gel 切胶纯化。然后把切胶纯化
的目的基因和plasmid A连接，transform之后筛选。
1,第一次得到大约10个colony，测序之后发现全部是plasmid A的序列。
2，这次把plasmid A用Nhe I和Age I酶切之后用Shrimp alkaline phosphatase处理，
然后再作连接。这次得到5个colony，简单的酶切鉴定之后发现全部又是plasmid A的。
electro-competent没有问题，做了阳性对照。不知道哪里有什么问题，谢谢。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 30 TBE的pH是8.3左右，你的蛋白如果pI是5应该跑得没问题的。但是250kD确实太大了，8%
的胶可能浓度还是高了。你要不要试试用5%的胶或者干脆用Agarose胶跑跑？我没用过
Agarose胶跑蛋白但我知道是可以用的。另外你最好还是确认一下在这个条件下蛋白有
没有aggregation，可以用Analytical Ultracentrifugation来看蛋白的aggregation，
不过那个实验用的蛋白量比较大。 |
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f*****Y
发帖数: 20 | 31 谢谢两位的回复。autoclave的过程中难道不会改变agarose的浓度或者使agarose dry
up？ |
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e********r
发帖数: 147 | 32 最近在用Co-IP的方法检测细菌细胞内的蛋白磷酸化水平（32P标记）。最后洗完
Protein-A agarose后，加2 X SDS上样缓冲液，如果直接吸一是太粘吸不出来，另外这
样的缓冲液里也没蛋白信号（文献上说37度处理5 min，试过不行，难道beads用的不一
样？）。如果100度煮5 min倒是能把蛋白从protein-A agarose上分离下来，但预实验
表明100度处理大概会使50%的磷酸化蛋白信号消失。请问做体内蛋白磷酸化检测的朋友
，还有别的什么着数可以用吗？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 33
这个的确是不太准。所以我们实验室就很讨厌用这个来做定量试验，但是，一般来讲，
多放一些agarose, 达到agarose 过量的程度，这样多一些少一些就比较无所谓了。
要用特别处理过的枪头，那种low protein binding 的。
这个只能多做几次重复试验，最后取平均值
这么低的浓度不会有问题。醇类在细胞内部是天然存在的代谢产物 |
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v******n
发帖数: 257 | 34 最近一直挣扎在这个chromatin IP上
用的是293细胞，死也做不出来。试过了两种beads，protein A support和santa cruz的
protein A/G agarose，背景超强。跟老板分析了半天应该是beads的问题。
请教一下做过类似实验的同学们，哪家的beads比较适合做ChIP啊？
在网上找到了两个，upstate的protein A agarose/salmon sperm DNA和GE的protein A
sepharose。哪个好一些呢？ |
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S*****s
发帖数: 287 | 35 What a good idea! 2% agarose in a petridish should be much cheaper than
those wax boards. I guess I just need to order some cheap agarose powder.
Thanks a lot for your help. I really appreciate!
with |
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S*****s
发帖数: 287 | 36 谢谢大家了。我一个朋友是这方面的专家，她已经带着我做过一次 Dissection，很让
我开眼界。看完了我自己试了几只老鼠，和牛人学过感觉就是不一样。现我们实验室的
解剖工具已经被折磨的不像样子了，尖头的镊子剪刀头都断了，剪刀也都是锈迹斑斑，
所以想订一些新的更换一下。
昨天我已经感叹过王朝兄的 2% agarose 了。我以前看朋友做这个实验都是垫粉红色的
蜡板，我觉得好处就是不粘组织，而且下刀的时候组织下面垫一个软的东西比较好切一
点。这东西也不是必须，不过用 2% agarose 的话比蜡板肯定便宜很多。今天看到
zhaohu 朋友的建议又让我拍了下桌子。就说版上牛人多！这些经验不具体做这个实验
肯定不知道。非常感谢！
朋友建议我订一个 dissection microscope，英文叫 stereomicroscope。我看了一下
Fisher 的网站，一个 Leica 的 S4 两千不到，S8 四千不到。不知道这个是不是必须
要订的？上周的解剖我用肉眼做的，看起来的确有点吃力，不过也不是完全搞不定。请
问一下各位朋友你们是直接用肉眼还是用哪种解剖显微镜？谢谢。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 37 1.没用过，不知道
2.什么意思？目的蛋白还是杂蛋白结合的agarose beads(Glutathione-agarose?)?目的
蛋白结合太紧？洗不下来？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 38 谢谢。再问一个白痴问题啊，你们在96孔板上铺半固体培养基的时候，如何避免
形成弯曲的表面？还是无所谓？还有里面的胶质，是regular agarose, low-melting
point agarose,还是 methyl-cellulose？ |
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k****o
发帖数: 589 | 39
用DSS是为了让抗体不被洗脱，以后还可以重复用agarose beads。交联这一步我是严格
按照厂家的protocol做的。Elution buffer根据厂家描述是酸性，pH2~3。洗脱应该是
没有问题的。洗脱后没有中和pH,但是厂家说这样没有问题。细胞裂解用的是Cell
Signaling的lysis buffer，用来做相同蛋白的WB从没有问题发生过。
你是建议我用Laemmli Sample Buffer洗脱吗？这样即使洗脱，agarose beads也无法重
复用了吧？ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 40 //products.invitrogen.com/ivgn/product/G2879
is half price of GE Life Glutathione Sepharose™ High Performance
Description
Glutathione agarose prepared by linking the sulfur atom of glutathione to crosslinked beaded agarose can
be used for purification of GST fusion proteins. Each milliliter of gel can bind approximately 5-6 mg of
boivine-liver GST.
-------
GE Life Glutathione Sepharose™ High Performance
Binding capacity* » 10 mg recombinant GST/ml medium
* Binding capacity wil... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 41 Use agarose conjugated with DnaseI to digest the DNA, then spin down the
agarose to remove the Dnase
get |
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g******t
发帖数: 230 | 42 抗体最重要，对好的抗体， Dynabeads 也就是锦上添花。对某些抗体，Dynal 的
binding 非常弱，结果还不如agarose beads (in my opinion, invitrogen oversold
it)。
不知道你有没有试过mix agarose A and G. |
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l**********1
发帖数: 5204 | 43 Sure
单特制小鼠抗体 做 ChIP （用millipore的salmon Sperm DNA/Protein Agarose 的话
魔都的Ab 比UK/States CA 的 可能成本要高一些
以下的各项列表
出去最高价格的 细胞融合及杂交瘤制备 10-16周 ￥16000 R M B
其它的各项累计 都可能超过欧美的特价的时侯的
更别说服务和质保了 可能今后有的还得美国UPS送同济去啊
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发信人: neverthink (nevernetbug), 信区: Biology
标 题: Re: ChIP 疑问（用millipore的salmon Sperm DNA/Protein Agarose，
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Jun 21 21:00:57 2012, 美东)
换抗体！抗体好， everything rocks! Ab sucks, nothing works!
PH8.
http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31684801.html
-----
魔都的link:
//www.glbio... 阅读全帖 |
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s*****a
发帖数: 59 | 44 His-tag protein was overexpressed in HEK293 cells.先用IP 纯化，接着做His-
purification变性条件来第二轮纯化（此顺序是实验需要，不要问为什么）。目前结果
是第一轮IP很好，但是His-purification后蛋白都在unbound fraction. 我用的是
Qiagen Ni-NTA Magnetic Agarose bead,据说适合纯化含量比较少的比如mammalian
cell的蛋白。IP后的蛋白都经过 buffer exchange，也没发现有与Ni resin
uncompatible的成分。请帮忙trouble shooting。会不会因为蛋白浓度太低导致与Ni
resin结合不好？His-purification有没有target protein concentration threshold?
是否需要改用binding capacity更大的Qiagen Ni-NTA agarose (不是magnetic bead)？ |
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m****M
发帖数: 360 | 45 我认为影响260/230比值的是你说的QG buffer，而不是agarose.
大家都在这里猜，还不如去测一下。
你可以用NANODROP测一下QG BUFFER的吸收峰，然后再测一个溶了agarose胶的QG
BUFFER测一下，看看有没有区别你就知道了。
同时你也可以测一下洗液的吸收峰在哪里。 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 46 Isolation of nuclei for the co-IP and whole ChIP protocols is based on the
methods of Gendrel et al. (2002, 2005), Johnson et al. (2002), and Nelson et
al. (2006).
METHOD
For extraction and co-IP of nuclear proteins, see Steps 1-39 (Fig. 1). For
the ChIP procedure, see Steps 40-69 (Fig. 2).
Figure 1.
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Figure 1.
Flowchart for the timeline and organization for co-IP of nuclear proteins
from Arabidopsis seedlings.
Figure 2.
View larger versio... 阅读全帖 |
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f******k
发帖数: 856 | 47 我这个问题很奇特，我用Invitrogen的dynabeads做ChIP-seq，最后拉下来的DNA量总是
比较高，做qPCR也没有enrichment，但是用同样的protocol，换回agarose beads，就
很少碰到这种问题。这不合理啊，dynabeads按理说背景要比agarose beads低很多才对
啊？！不知道大家有没有碰到这种情况？我试过好几种洗的方法和试剂，比如最常用的
就是低盐洗一次，高盐洗一次,LiCl洗一次，TE洗两次。也试过用RIPA洗过，也试过大
量延长洗的时间，但是最后elute下来DNA的量还是比较高。
另外，能不能请推荐一个比较好的做转录因子ChIP-seq的盒子或者详细的homemade
protocol？我做的这个转录因子，比较low abundant，可是我的材料是primary tissue
，又没法一次拿到很多的细胞（一次运气好的话可以有50-100million）。看有的文章
说现在10million就可以做转录因子的ChIP-seq了，可是我从来没成功过。现在真是快
被逼死啦。。。。快救救我 ：（ |
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f******k
发帖数: 856 | 48 我也是折腾了好久，打算放弃磁珠了。那请问用agarose你是如何解决salmon sperm干
扰测序的问题呢？当然可能你不用salmon sperm DNA blocked agarose beads? |
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w*e
发帖数: 740 | 49 agarose conjugated 还能用magnetic beads么？
没用过agarose的，不知道该注意啥
谢谢 |
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l*******1
发帖数: 16217 | 50 是不是agarose浓度没调对，还是loading buffer点孔的时候出了问题 |
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