z*t
发帖数: 863 | 1 1000个细胞其实可以搞到lysis里直接做了,RNA-seq不了解，可能麻烦些，很多人直接
这么做qPCR的 |
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z*t
发帖数: 863 | 2 1000个细胞其实可以搞到lysis里直接做了,RNA-seq不了解，可能麻烦些，很多人直接
这么做qPCR的 |
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q******g
发帖数: 3858 | 3 For example, within this transporter, can you identify the key amino acid
residues or protein domains that affect the compound binding?
We will examine the amino acid uptake in oocytes expressing mutant with
compound.
Second, can you synthesize a fluorophore or radiation conjugated version of
this new compound you discovered? If yes, you should be able to test its
interaction with your transporter by IP.
This is a revesible inhibitor for transporter. I am afraid that compound
will not bind to t... 阅读全帖 |
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L*********y
发帖数: 322 | 4
of
What is the Kd of this compound? Does the inhibition depend on the presence
of the cargo carried by the transporter? You don't have to do this
experiments in lysis buffer. The transporter protein, ideally with a tag can
be prepared from oocyte, then you throw the labelled compound in the oocyte
system. After pulling-down the transporter, the binding can be analyzed
through assaying the amount of compound incorporated into this transporter.
findings?
I agree it is not a direct biochemical exp... 阅读全帖 |
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d*p
发帖数: 534 | 5 国内临床上还是在用这个cik, cik+dc， cik 我前面讲了，这里就只讲一下dc。
dc vaccine 的应用有两个主要问题， 一是dc既可以激活免疫反应，也可抑制免疫反应
，如何做到高效激活针对肿瘤抗原的免疫反应，还有很多工作要做，并不是简单地将体
外培养的dc与抗原混合就够了。二是缺乏有效的肿瘤抗原，这个与传统的肿瘤抗原鉴定
方法的低效率有关，国内很多地方就是用肿瘤细胞lysis的蛋白来做抗原，这里面有多
少是肿瘤抗原，你想想就知道了。
dc vaccine 是非常有希望的一个方向，现在发展很快，改进方法也很多，未来5年左右
应该会有不少新的治疗性疫苗出现。而与现有其他治疗方法结合，也是大势所趋。
cells |
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a********k
发帖数: 2273 | 6 想室温保存一年，然后用细胞悬液直接提gDNA。很多公司卖buffer,不知道有没有简单
点的配方？比如加个稀释的Lysis buffer之类的。
谢谢了。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 7 做了一个实验，用药处理细胞后取mRNA，发现mRNA增加非常多。然后又做了一次试验取
protein，看看这个基因的蛋白 western水平有没有增加，结果发现蛋白水平没有增加
。因为一般来说mRNA增加很多protein也会相应增加。不知道是那里做错了，为了同时
做mRNA和protein，打算用dadish养细胞并加药处理，收集细胞后一分为二，分别做RNA
和protein。
打算这样做：收集细胞的时候先把细胞刮下来，离心后重悬，然后一分为二，分别加入
RNA和protein的lysis buffer。
问题：我还想用这些protein检测post-translational modifications，比如磷酸化乙
酰化什么的。
在收集细胞过程中，这些post-translational modifications可能改变，能不能用PBS
把medium洗掉之后用4%的formaldehyde固定一下细胞，保留所有post-translational
modifications？
请大家指点一下。谢谢！ |
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w*****r
发帖数: 2061 | 8 搭车问PCR的问题，干细胞克隆筛选，几百个细胞，Viagen DirectPCR Lysis，只能P出
来几百bp的片段，1kb以上的PCR就是各种杂带，乙醇沉淀纯化也没有帮助 |
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m**z
发帖数: 787 | 9 possible. try wash the cell with some chelator before lysis. or even make a
protoplast. |
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m******5
发帖数: 1383 | 10 小弟现在正在做Chip
所用抗体IP effeciency尚可
目前打算用此抗体做Chip,不过问题来了，sample crosslink, lysis， 以及dilute后
用Beads-antibody pulldown，之后用protein loading buffer煮30分钟后上SDS-page.
跑SDS-page后目的带附近什么也没有。 同一块胶的阳性对照也正常
input目的带也没有跑出来
请问有同学遇到过这种问题么？
补充说明一下，Chip所用材料是invivo knock in了一个tag的老鼠的组织。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 11 目前在做小肠组织的western，给RIPA buffer把SDS加到2%，然后sigma的protease
inhibitor cocktail加标准量的4倍(标准量是1：100稀释用的)，但是每次lysate里面
都有蛋白降解。。。。。。。。所以想除了inhibitor cocktail还能加点啥瞬间灭火
protease还能用于western？ |
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d****i
发帖数: 2346 | 12 同时再问一个问题：
昨天做western，上完样品就把lysate(已经加了sample buffer)顺手放在桌子上了，然
后走的时候忘了收到冰箱，在试验台上放了一晚上。问一下，蛋白会不会降解？ |
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d****i
发帖数: 2346 | 13 同时再问一个问题：
昨天做western，上完样品就把lysate(已经加了sample buffer)顺手放在桌子上了，然
后走的时候忘了收到冰箱，在试验台上放了一晚上。问一下，蛋白会不会降解？ |
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i***l
发帖数: 1656 | 15 3-4M urea
without SDS otherwise homogenization generates tons of bubbles which are
what you do not want.
i'd discard samples left at RT due to degradation. |
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d****i
发帖数: 2346 | 17
确实有很多泡泡，很烦人。
3-4M urea会不会太高了？ |
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i***l
发帖数: 1656 | 19 i am telling you the trick i used
you are questioning me about my trick
what do you want to hear from me?
before asking"3-4M urea会不会太高了" have you check why use urea and what's
the usual range of urea used in denaturing buffer?
what's the conc. you think is better? |
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h*******o
发帖数: 4884 | 20 我个人感觉用液氮snap freeze以后直接pulverize的效果最好 顺手还可以分成aliquot
然后-80保存， 以后要homogenize 的时候拿出来直接加lysisbuffer
放bullet blender 放在冰柜里面打， 打完以后至少放冰上
protease inhibitor用多了没有什么额外作用 |
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c*z
发帖数: 157 | 22 RIN有6已经不错了
fresh frozen LCM关键是切下来立马要进lysis buffer，不过你这个case这些都不是问题
如果core没做错什么的话。。
要不。。truseq。。难道3’没处理好或者adaptor没连好？ |
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n*********s
发帖数: 552 | 23 谢谢答复，不过不是BAL，就是貌似注射器灌好hbss，然后从心脏打进去，hbss从心脏
进入肺里，肺就鼓起来了。是要去掉red blood cell吗？那为什么不用RBC lysis
buffer呢？ |
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E*0
发帖数: 63 | 24 对的，目的就是为了去掉肺部的所有血细胞，结束以后肺应该是纯白色，为进一步分离
原代细胞做准备。测流感病毒titer可以不做perfuse。lysis buffer是专门裂解已经分
离好样品中污染的RBC的。希望这些信息会有帮助。 |
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s********r
发帖数: 312 | 25 做的干净基本上是检测不到的，一般推荐拿掉cyto的supernatant后，pellet用预冷PBS
vortex/Spin down洗3-5遍，然后再加nucleus lysis buffer |
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f**********s
发帖数: 1415 | 26 分离细胞核后，想用denature immunoprecipitation纯化一种可溶性核蛋白，包子求一
个lysis buffer配方和protocol. Thanks. |
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r******k
发帖数: 446 | 27 If i used whole cell lysis ( with our cell fractionation), i saw very
abundance of protein bands with the stain of ponceau S. However, after i
fractionated the sample, it seems nothing can be detected, even in the
cytosol. I have no idea why. 难道cyto/nucleus被抽出来的过程会使得蛋白降解？ |
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A******y
发帖数: 2041 | 28 Quick question, does triton 100 alone consider hypotonic lysis and you will
only get cytosolic portion? |
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r******k
发帖数: 446 | 29 大神们
1。 你们co ip precleaning多长时间？ 我们实验室要3hr 在4度 rotate 是不是太长
了？
2. 加了IP lysis buffer 以后你们会用sonicator超声一下吗？ 还是就是直接放冰上
放个30-40min？
多谢呀！！！！ |
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h*j
发帖数: 77 | 30 1。 你们co ip precleaning多长时间？ 我们实验室要3hr 在4度 rotate 是不是太长
了？
1小时足够了。
2. 加了IP lysis buffer 以后你们会用sonicator超声一下吗？ 还是就是直接放冰上
放个30-40min？
两种方法都可。如果真是associated, sonication不会有影响。直接放冰上放个30-
40min常常裂解不完全。我用1ML的胰岛素注射针抽吸10次也可。 |
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r******k
发帖数: 446 | 31 就是我overexpress p53的一个mutation进到hela cell，然后做western。 我不知道那
些是unsepecific bands 还是因为我lysis buffer不强 p53有dimer之类的没打开。。 |
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r******k
发帖数: 446 | 32 有大神用过Lambda Phosphatase吗？ 有没有一些具体的protocol呀？怎么往lysis里面
加呢？按什么样的比例呢？？？ |
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s********8
发帖数: 619 | 33 有人有经验吗?
手上的课题需要从极少量的FACSed细胞中提取RNA做RNAseq.现在一次sorting只能拿到
差不多3000个细胞,运气好的话应该一次可以拿到6000个细胞.
本来打算直接sort到Trizol里面冻起来,这样多sort几次,攒在一起提RNA.可是FACS
facility又不让我用Trizol,所以现在是sort到 RNaqueous micro kit 的lysis buffer
里.提完了RNA一测,几乎啥也测不出来,因为大概也只有十几个ng的样子.
所以我是不是应该考虑用commercial kit来做个amplification?求大牛推荐kit或者好
的方法! |
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a*******g
发帖数: 33 | 34 样品在lysis buffer中可以冻起来，等收集几次之后pool在一起提取，不用扩增的话，
100ng就可以做sequence了。如果你需要测的样品比较多，嫌麻烦的话，10ng可以扩增
的。总体上，人们倾向不扩增。提起少量rna，有life tech的picropure和qigen的
rneasy micro kit,测浓度用life tech的quit,质量用aligent的picro chip。 |
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r******k
发帖数: 446 | 35 我晕 这么讲究。。。 我有的时候用有phos-stop和 protease inhibitor的pbs洗，有
的时候就是用普通的ice cold pbs洗。 然后加lysis buffer，还超声。。。。。。。
。。 感觉要是有的还是有 要是没有怎么都没有。。。嘻嘻
而且楼主做磷酸化不用BCA定量吗？ 其实我觉得磷酸化没那么容易就去掉，不然大家干
嘛还要有lambada phosphotase去磷酸化做control呢 |
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r******k
发帖数: 446 | 36 sunny老师 一定要液氮速冻吗？ 直接放-20 或者-80不行吗？
有的时候有事儿 把lysis 直接放-80 或者-20 第二天再家sds buffer boil 好像也没
啥问题。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 37 身边不同人意见不同。。。。。。。谢谢！
目的是裂解细胞抽取蛋白做western。buffer里还有SDS, GLYCEROL. |
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s******y
发帖数: 28562 | 43 需要加热，不然的话细胞里释放出来的DNA 会把溶液搞得非常的粘 |
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d****i
发帖数: 2346 | 44
DNA我想用sonicate打碎。据说尿素加热分解会影响蛋白修饰。周围人说法不一。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 45
是的，尿素加热会影响蛋白修饰。主要是有些修饰会产生化学反应。 |
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K******S
发帖数: 10109 | 46 don't do 95 degree or boiling, control the temperature under 60 and you will
be fine. |
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f*******d
发帖数: 92 | 47 哦？那么heating之后DNA就沉淀了还是断了呢？ |
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d****i
发帖数: 2346 | 48 配尿素溶液时候说是不能超过37度，你这里说60是怎么回事？
[在 KingofMS (你太有才了) 的大作中提到：]
：don't do 95 degree or boiling, control the temperature under 60 and
you will be fine.
：
：........... |
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r*****8
发帖数: 2560 | 49 有SDS必须加热到95C,或者沸水浴5分钟。
目的是把蛋白质变为单链。
跟尿素没关系。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 50 尿素不是可以变性吗？
[在 rabbit8 (兔子) 的大作中提到：]
：
：有SDS必须加热到95C,或者沸水浴5分钟。
：........... |
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