h*****G
发帖数: 113 | 1 human embryonic stem cell， 用puromycin和G418 select double positive 的细胞。
一般大家是puromycin和G418一起加，还是先加puromycin，过几天后再加G418? 谢谢。 |
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b****h
发帖数: 18 | 3 the idea is to knock in Neo in hESC, driven by neuron-specific promoter,
then differentiated into neuron. Only specific neuron can survive under G418
pressure. I also think it will be slow, puromycin is faster? I am not sure
for neuron, as they cannot proliferate.Any experience will be highly
appreciated. Facs cannot be used for attached neurons. |
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e**r
发帖数: 1144 | 4 最近用puromycin杀细胞
发现puro超过一定浓度后（3ug/ml左右）,再增加浓度细胞死的反而越来越少了，一直
增加
到几百ug/ml,远远超过正常浓度，存活的细胞仍然是增加的趋势
最极端的，用10mg/ml stock泡了两天，存活的细胞居然比3ug/ml要多
有人注意到过这种现象没？
这是为什么？ |
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m*********D
发帖数: 1727 | 5 （CRISPR的背景资料请参阅Feng Zhang的“Genome engineering using the CRISPR-
Cas9 system”，Nature Protocols 8, 2281–2308 (2013)）
背景
我们是作一个与激素相关的肿瘤的。这个肿瘤的治疗方法已经相当完善，就是让身体里
不能生产激素或用一个小分子化合物抢占激素受体上激素的结合部位。但多年治疗后，
会有相当比例的病人产生抗药性。这个抗药性机理相当复杂。我们实验室一直致力于筛
选和现有药物不同的机理的小分子化合物，包括受体和DNA的结合或其他与受体相关的
pathway的inhibitors。前几年成功地筛选出了几个不同机理的化合物，个别在细胞水
平达到了nM的级别，动物测试也在10 mg/kg的水平。
最近在这个领域对抗药性肿瘤的研究发现，部分病人的抗药性是因为受体激素结合部位
发生了突变。一个或几个氨基酸的突变就能导致肿瘤细胞的生长不能被现有药物抑制。
所以，我们很想知道我们筛选出来的化合物对这些突变受体是不是也起作用。理论上来
说，我们的化合物不和激素竞争，突变不会影响我们化合物的效果。但只... 阅读全帖 |
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H****s
发帖数: 301 | 6 It depends on your purpose and the cell line to be transfected. Generally
speaking, if you cell line is tough enough, puromycin is much easier to work
with. You just need to add a relevant amount of puromycin to the media and
it starts killing.
For neomycin and hygromycin, you have to determine optimal killing
concentration specific to the cell line you will use. To initiate killing,
you have to split cells and supplement with neo/hygro containing media.
Every selective marker has its specific p... 阅读全帖 |
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m**1
发帖数: 2 | 7 我想用Lentivirus介导针对某一基因ShRNA感染U2OS细胞以Knockdown该基因的表达，结
果是反复几次均未成功----感染U2OS细胞后用Puromycin筛选，细胞全部死亡。这说明
可能1）Lentivirus没有包装成功2）U2OS对Lentivirus敏感3）----？
我有该种Lentiviral表达质粒直接用Fugene
6转染U2OS细胞，然后用puromycin
筛选，有大部分细胞survival,说明Lentiviral表达质粒没有问题。
我包装Lentivirus的过程是：
Co-transfect下列质粒至 293T 细胞（用Fugene
6），48小时后，将上清液过滤，直接加到U2OS细胞上，48小时后加入Puromycin进行筛
选。
Lentiviral质粒 5ug
Gap 2ug
Rev 2ug
VSVG 2ug DNA总量 11ug, Fugene reagent 33ul.
第二次加大了DNA量，但还是不成功。
Lentiviral 质粒 10ug
Gap 3ug
Rev 3ug
VsVG 3ug DNA 总量19ug,Fugene 57 |
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C***Y
发帖数: 61 | 8 I am trying to generate cell line with inducible knockdown. I used Tet-pLKO
-puro, in which a puromycin resistant gene is placed downstream of pGK-TetR-
IRES. The problem I am having now is that the expression level of puromycin
resistant gene was so low that all the cells were killed by puromycin. I
heard that the single vector Tet-induicible system selling by Clontech is
not very good either. Have anyone found any system satisfactory?
Thanks. |
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E*********4
发帖数: 16 | 9 我把一个蛋白的基因插在本来是shRNA的位点（AgeI site），做了transient
overexpression，可以做puromycin筛选，检测到蛋白表达，但是做了virus之后，加
puromycin，细胞全死了，说明puromycin没有表达。这是为什么呢？BTW，在我的基因
前加或者不加promoter，会有什么影响吗？
这是Tet-pLKO-puro的链接：
https://www.addgene.org/21915/
非常感谢！ |
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m*********D
发帖数: 1727 | 10 他science文章的protocol里是puromycin七天，然后是drug treatment七天或十四天。
要整合的话（stable cell line)，时间是该差不多了。
你说的先作Cas9的stable我要考虑一下。就是作stable cell line太花时间。Cas9的表
达silence问题该不大。一般stable在我手里是三个月之后才出现基因表达走下坡。
Lentivirus感染效率高的话，一个vector省很多事啊。上次作点突变，我用普通的
lipofectamine 3000作transfection, 效率太差，少于10%的细胞能在三天的puromycin
selection后活下来。也许我用的puromycin量太高，2.5ug/ml。当时作了一个三天的
killing，找到能三天杀完host cell的最低量，就用上了。
再向你请教一下：vector整合进genome后，拿到genomic DNA，再用primers来扩增整合
的guide Sequences。这对PCR primers 就是直接从vector来的吗？我想象这对primers
正好在gu... 阅读全帖 |
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a******n
发帖数: 392 | 11 多谢。如果用lentiviral shRNA，infection 之后几天可以用puromycin测定
transduction的效率？ 在加puromycin之
前，需要把细胞重新plate吗？ |
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a*****g
发帖数: 543 | 12 I guess Q-PCR your target mRNA is worth it. (Although figuring it out does n
ot solve the Kd problem).
It's odd that three clones didn't work. Unless your gene is super essential,
and the mediocre-infected cells survived. What's the death rate after selec
tion?
Rather, I assume you have a non-infected cell line treated with same dose of
puromycin and observed complete cell death?
Some cells are just more tolerating to puromycin than others. |
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T**********r
发帖数: 287 | 13
does n
essential,
selec
dose of
多谢答复，我所用lentivirus vector上都带有tubo GFP,所以puromycin筛选时,我拿到
是100%绿的cell line，对照组相同浓度的puromycin在一天内就可以将没转染的细胞杀
死。
我要knock down的基因是个转录因子，在发育中决定cell fate determination。
一个set中三个克隆都不起作用，很少见吗，以前做knock down比较少. |
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H****s
发帖数: 301 | 14 对于puromycin抗性的克隆筛选来说，这种情况是非常普遍的。看看你的载体吧，如果
标靶基因和puromycin抗性是由不同的启动子驱动的，那么你运气不太好，需要多筛选
克隆。主要有两种解释：（1）lentiviral/retroviral载体介导的异源表达，很普遍的
一个现象是整合到基因组的序列被flanking genomic sequences灭活。具体怎么回事，
现在还不太好解释。（2）低表达或者是不表达的细胞outgrow表达标靶蛋白的细胞，所
以，几代以后，你基本上丧失标靶蛋白的表达。
有两个建议：
（1）。使用抗性基因和标靶基因被同一启动子驱动的载体。标靶基因和抗性基因中间
有IRES。这样，产生抗性的细胞系必然表达标靶蛋白。如果被flanking genomic
sequences灭活的话，细胞会死亡，因为抗性丢失。
（2）。如果筛选到合适的细胞系，在前面几代要多冻存细胞。这样在后面的实验中你
不会丢失辛辛苦苦得来的细胞系。 |
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C***Y
发帖数: 61 | 15 I usually add puromycin to cells 36 hrs after transduction,
and harvest cells for RNA 72 hrs after adding puromycin. You should be able
to get enough cells for microarray this way. Actually, I am testing inducible systems now,
and the problem I having now is leakage.
？ |
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m**********d
发帖数: 137 | 16 in vitro用luciferase标记肿瘤细胞，打入体内，用bioluminescence和PET/CT跟踪肿
瘤生长和转移
有个很基本的问题没搞明白，我查看实验室前人的notebook发现他当年用transient
transfection转染了一个表达luciferase的plasmid进去，用puromycin筛选一段时间，
就打进老鼠里去了，我在想他为啥不用lentivirus来做stable cell，像他那样做的
transient transfection随着肿瘤细胞的不断分裂岂不是早被dilute了，就算在in
vitro一直有puromycin的selection pressure，那达到体内之后呢？总之觉得不大靠谱
，可那位前辈已经离开了lab，所以来这里请教请教
多谢 |
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m**********d
发帖数: 137 | 17 之前做过很多lentivirus，都是超速离心virus之后infect细胞，transduction效率都
还不错，这次偷懒没离心，直接用的含有病毒的medium，可是puromycin select一两天
后细胞全死光了，以下是详细的protocol:
vector用的是pBABE-Luc （基于pBABE-puro,只不过也表达luciferase）
293T细胞，养在75cm2 flask里，用lipofectamine2000转染的，包装病毒用的是second
generation packaging system (PAX2,pMD2.G)
分别于转染后48hr和72hr collect medium，过了一下0.45uM的filter，又加了8ug/ml
的polybrene，就加到要transduce的细胞里去了，24hr之后开始puromycin selection
我能想到的问题可能是准备transduce的细胞有点太confluent了，但这也没法解释全死
光的结果，我想很可能是没有病毒包装，高人们帮忙看看这过程中可能是么出了问题 |
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m**********d
发帖数: 137 | 18 多谢楼上几位的热心回复！
我所用的细胞已经带有一个puromycin resistant的luciferase construct了，因此在
病毒infection之后没有办法再用puromycin筛选，幸好pTRIPZ vector有RFP，我用FASC
sorting拿到的细胞pool |
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y*********u
发帖数: 183 | 19 请问有哪些commercial available的质粒好用的？
有人用过如下这个质粒么？
Generation of a double-fluorescent double-selectable Cre/loxP indicator
vector for monitoring of intracellular recombination events.
Pfannkuche K, Wunderlich FT, Doss MX, Spitkovsky D, Reppel M, Sachinidis A,
Hescheler J.
Source
Institute for Neurophysiology, Robert Koch Str. 39, 50931 Cologne, Germany.
Abstract
Here we describe the generation of a double-fluorescent Cre/loxP indicator
system. This protocol involves (i) all cloning steps to generate ... 阅读全帖 |
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d****d
发帖数: 214 | 20 T2A编码的是一个peptide，可以连接两个蛋白质的coding sequence使其转录时为一个
mRNA但在翻译时分开成为两个独立的蛋白。
以你的问题为例子，你可以在T2A上游插入你感兴趣的蛋白质的coding sequence，最终
你的蛋白和puromycin resistant gene (Puromycin N-acetyl-tranferase)所编码的蛋
白会被翻译成两个蛋白。这种同时表达多个基因的策略同IRES策略相比，好处是上下游
蛋白的比例理论上讲是严格的1：1. |
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t**********a
发帖数: 14 | 21 我用的lentivirus 感染而不是siRNA。
lentivirus感染后第二天换液，不加puromycin筛选，前2天细胞长得好好的，3天后细
胞开始减少，而对照一直长得好。
如果加pyromycin筛选的话3-5天后细胞开始减少（未感染的blank细胞在加puromycin后
第二天几乎全死光），直到剩下寥寥无几（估计是感染效率不高的细胞），得1-2周后
才慢慢长满，此时细胞生长仍然慢于对照细胞。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 22 恩
多谢楼上各位，怀疑转染效率不够，但是之前也用过lentiviral shRNA+puromycin
selection的，结果跟这次用siRNA差不多，当时就发现G1的比例很高，怀疑是
puromycin对细胞周期有干扰，所以转用siRNA的，不明白为什么control的时候G1的比
例都那么高 |
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L****T
发帖数: 169 | 23 1，把shRNA质粒送去测一下序列（国内公司一般测不出来不收钱），很可能在你把质粒
带回国重新转化抽质粒过程搞混了。
2，另外，你puromycin杀了几天？有些shRNA筛选时间长了虽然细胞还耐受puromycin但
U6会被silence。
3，自己重新再做几个shRNA呗，国内引物合成便宜。 |
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R*s
发帖数: 2041 | 24 for stable transfection: u include a selective marker (such as G418,
puromycin) in the DNA construct will transfect cells with. Then by
including the antibiotics (G18, puro...) in the media, you will be
able to seletively grow up the cells trasfected with your construct, while
killing the untrasfected ones.
For transient transfection: you don't have such selective markers in
the constracuts. You will always grow cells in regular media. Since it
is impossible to achieve 100% transfection, there i |
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s******y
发帖数: 28562 | 26 很多细胞会变异而产生对ｐｕｒｏ的抵抗力的，尤其如果你用的是癌细胞的话
我做类似试验的时候，都是在用药一个星期后必须用荧光ｓｏｒｔｉｎｇ
一此
，但是传代几 |
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l**********n
发帖数: 240 | 27 我用的是从成年大鼠分离的血管平滑肌细胞, Passage 1-3. 这种原代细胞变异可能性
大吗？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 28 No, those cells should not have big probability to mutate
Anyway I would still suggest you to do a sorting if possible (if your cells
can survive sorting). |
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n********k
发帖数: 2818 | 29 promotor silencing is more common than what people might appreciate, it is
very common for one to have
resistent clones but without overexpression, in ur case would be shRNA, so u
would have to do western/rt-
pcr to check it out, as well, it is rare to keep viral infected cells as
stable line because it is widely
recoginzed/believed that the expression goes down dramatically after a
couple of passages...the same goes
with tranfected cells...so the rule of thumb in general is to not to use
them a |
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l**********n
发帖数: 240 | 31 Thanks very much for your help!
I will prepare new batch of cells for infection and avoid passaging
cells after infection.
u |
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s******y
发帖数: 28562 | 32 我被你的其中一个说法吓了一跳，你说病毒转染的细胞不适合于做stable
cell line? 那大家都是怎么作stable cell line 的呀？
尤其是很多细胞不是那么容易直接用质粒转染的，比方说我们实验室用的
fibroblast, B cell等等，不用病毒几乎就没有其他办法了。
而我们又特别不喜欢挑单克隆，因为我们一般来讲，转染细胞是为了做
phenotype rescue的，如果用单克隆的话不要说reviewer, 连我们自己
都不能说服。
我们的确注意到retro virus 转染的细胞过一阵子后荧光会变少。
我们的解决办法是把头几批细胞经过sorting 后再养一天，然后统统冻起来，
只用那几批细胞。不知道这么行不？能不能说服reviewer? 或者你们实验室
有更好的方法？
u |
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n********k
发帖数: 2818 | 34 unless in special occasions/needed/desired(say u don't want the high
expression etc), what's the point making stable cell lines if you use
retroviral approach...I(many if not most) rarely keep them as stable lines..
..Nolan's lab is an excellent place for viral stuff...Yes, u can keep them
as stable cell lines,but you would have to take much precautions...single
clones is an old old(updated too) approach...of course u cannot do one
clones, u need at least dozens of clones intially and then narro |
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p**i
发帖数: 3525 | 35 直接用质粒转的stable line呢，好些吗?
u |
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n********k
发帖数: 2818 | 36 BTW, the way u are doing is likely fine...within several passage is fine or
as long as they are well-chaterized, it is fine...but is it that hard to go
retroviral and treat them as transient approach...I rarely keep any stable
cell lines now...And for many studies, it is impossible or not right to keep
stable cell lines because the manipulation cause them to change...for
example differentiation...so u are screening against the correct phenotypes.
..anyway, nothing is absolute and it all depends. |
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n********k
发帖数: 2818 | 37 I would go for either inducible clones or go viral approach but as transient
approaches...单克隆 is out of dated generally speaking though. and in many
occasions, to have stable clones is not right or simply impossible. and it
depends on reviewers too...I would say most of reviewers will buy viral
approach as transient approach while some hates single clones unless it is
very well characterized with many clones...if one is not careful enough, one
could get single clones of whatever desired phenotyp |
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n********k
发帖数: 2818 | 38 likely yes, but never compare that(besides the normal silencing, retroviral
has extra silencing effects)...but for single clones, u are picking those
with good/reasonable expressions, so there isn't a real issue in term of
promoter silencing because you already exclude those when u pick the clones.. |
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p**i
发帖数: 3525 | 39 xiexie，很有道理。那如何做才是现代的最有说服力的细胞实验呢? 我们一般是加例如
GFP-tag，
然后用retroviruses转染建立几个细胞系，然后看接受信号后的蛋白移动。
inducible clones 是否比较不过时有说服力?
transient
many
one |
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n********k
发帖数: 2818 | 40 don't know, I haven't followed closely lately with this as I do mostly in
vivo now...in vitro is just for confirmation or mechanistic probing...for ur
case, it is likely less a problem...I am more talking about in term of
phenotypical changes...BTW, as I said earlier, I don't see why you have to
use stable cell lines if with retroviral... |
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s******y
发帖数: 28562 | 41 很多场合下我们没有别的选择阿
另外，逆转录病毒载体也有高表达的promoter的。比方说pQC vector
我们有时候不喜欢选克隆，是因为我们做的是癌症，而癌症细胞本身就是
一个很复杂的群体，如果不是整个群体都得到一定程度的rescue我们会
感到害怕下结论，如果只挑几十个克隆我们会担心的。
..
experiment, |
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s******y
发帖数: 28562 | 43 我们的策略就是不挑克隆。
转染一个10cm 碟的细胞，然后药选一个星期（一般能得到至少几万个不同的隆），sorting, 然后看整个群体的性状。
但是我们本身也不是做癌症研究出身的，所以不知道这个是否被同行认可。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 44 inducible clones 也有很多麻烦，特别是很多inducible line 并不是很严格
的inducible.或者inducer 对细胞毒害很大 |
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l**********n
发帖数: 240 | 45 细胞膜带负电荷，影响病毒颗粒附着。
polybrene 带正电荷能中和部分细胞膜的电荷，因而能facilitate particle
attachment.
我用lentivirus， （with polybrene）在人血管平滑肌细胞达到70％感染率(assessed
by puromycin resistence)，在大鼠细胞达到30%. |
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T****r
发帖数: 4006 | 46 shRNA vector有puromycin selection? 用药晒一下...
不然就用lentiviral shRNA vector, 直接做成virus 转染.... |
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D******9
发帖数: 2665 | 47 想在LEUKEMIA的细胞系中用lentiviral shRNA KNOCKDOWN一个基因， 打算用puromycin筛
选，跟贴壁细胞一样做么？ 死细胞怎么除去呀？ 每次加新药都要先离心吗？谢谢 |
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T**********r
发帖数: 287 | 48 针对一个基因，order了3个Thermo GIPZ lentivirus shRNAmir，侵染细胞，通过
puromycin
获得stable cell line，之后通过western blot检测，三组shRNAmir都没有明显降低蛋
白水
平。这种情况是否有必要用realtime PCR在检测一下，希望牛人能推荐一下好用的Q-
PCR kit. |
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T**********r
发帖数: 287 | 49
inducible
多谢提醒，不过你提到这个是openbiosystem的另外一个系统TRIPZ，的确是用
tetracyline
induce的。
Open biosystem有两种shRNAmir系统实现knock down:
a.Stable knockdown: GIPZ；shRNAmir is constitutively expressed as a
polycistronicvector that codes for tGFP, puromycin resistance
marker (Puror) and the shRNAmir.
b.Regulated knockdown: pTRIPZ,也是你提到的。
见链接
http://www.openbiosystems.com/collateral/rnai/pi/Lentiviral%20shRNAmir%2
0for%20Stable%20and%20Regulatable%20RNAi.pdf
再次真诚感谢，有了质疑，才能避免将来实验走弯路。 |
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z****g
发帖数: 3340 | 50 人primary fibroblast用spinning的方法转染pBabe-puro病毒,感觉puromycin
selection之后,细胞不长了,形态似乎也发生了变化(空载体的对照也是).
有经验的大虾show一下你的经验.前后转了两次都一样,有点失望. |
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