l**********k
发帖数: 189 | 1 发一个招聘，麻烦版主保留几天。谢谢。
我们是一家专门从事利用基因敲除模式小鼠进行自身免疫疾病药物筛选和提供
基因敲除小鼠CRO服务的生物技术公司。因为规模扩大，需要招聘以下人才：
1. 课题负责人(Scientist/group leader)：
根据客户的要求，进行基因敲除小鼠课题设计 (包括基因剔除，条件性基因
提出，基因嵌入等)。您需要有博士学位，具有两年以上相关领域独立工作经验
(或博士后经验)。具有丰富的制备基因剔除类小鼠模型的设计及亲手操作经验。
具有良好的人际交往能力，良好的工作态度，以课题为中心。
2. 显微注射技术人员
要求：具有熟练的转基因小鼠和囊胚显微注射，胚胎操作经验。
3. 同时，我们公司招聘在基因敲除大鼠，人胚胎干细胞gene-targeting方面有
丰富经验的课题负责人。要求你有博士学位，具有多年相关领域的设计及亲手
操作经验。具有良好的人际交往能力，良好的工作态度。
公司地址在麻州中部 (Worcester)和北京。 公司网站：www.biocytogen.com.
如果您感兴趣，请您联系 [email protected]。 |
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t****p
发帖数: 1504 | 2 K14是表达在基底细胞，也即通常说的皮肤干细胞，一旦发生敲除就永久敲除，皮肤干
细胞理论上不会丢失，所以不存在4周以后就没有了的问题。
K14-CreERT2的效率不是很高，假设你诱导敲除一半的细胞，那么另一半的细胞足以掩
盖敲除细胞的缺陷。除非你的基因特别强大。我觉的K14-CreERT2作为tracing的工具鼠
就好，要用它研究基因在成体小鼠中的功能并不是很好用，主要就是诱导效率还不够高。 |
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m********5
发帖数: 17667 | 3 我今天看了不少相关论文，发现CCR5缺失在人类中是存在的啊，北欧不是说10%人口都
有这个缺失，这些人并没有什么其他明显缺陷啊。因此可以说这个CCR5敲除相当于做了
几万年的临床实验了。有生物学者说置于多大未知风险，完全是耸人听闻嘛。
唯一的问题是脱靶，但是这医生在植入前后都证明了出生的胎儿没脱靶，那么就是安全
的，有什么问题么？
我看很多人就是妒忌罢了。我认为在父母罹患艾滋病的情况下进行CCR5敲除并没有什么
伦理问题。当然，对于严重遗传病基因进行修改才是最紧迫的，但是凡事都有个过程，
简单的不做，复杂的更做不成。对这次基因敲除实验我还是鼓掌的。但是我认为团队进
行大力宣传是错误的。
需要杜绝的反而是大规模的基因优化，因为这些是局部优化，而且是趋同，在彻底研究
清楚所有基因之间的相互作用和表达规律之前搞这些，会导致人类这个种群在未知风险
前变得脆弱。 |
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m********5
发帖数: 17667 | 4 注意是双胞胎，敲除之前还有很多胚胎
他完全可以把未敲除的基因全序测一遍
然后和敲除后的对比，看有什么变化 |
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T*****e
发帖数: 247 | 5 这个是不同概念吧
conditional knockout可以是inducible knockout，这一般也是tissue-specific
knockout，有的时候似乎只是说tissue-specific knockout
所以相对应的如果是时间上一直敲除，就是constitutive knockout，如果是空间上全
身敲除就是global knockout
所以不特别强调的完全敲除应该就是knockout，或者想fancy一点那么可能是tissue-
specific knockout，虽然时间上还是constitutive knockout
有点绕，不过你的明白 |
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h**********r
发帖数: 671 | 6 想用Wanner Lambda Red Gene Disruption系统敲除E. coli的6个基因，别人报道过了
，没有问题。
一个一个的敲费时啊，能不能同时转化两个PCR产物，分别用Km和Cm的抗性，筛选Km Cm
的抗性，然后切断marker,再做下一次的两个基因的敲除。
求建议！有包子！
多谢！ |
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h******o
发帖数: 9 | 7 查了些资料，对这两个名词有所了解，但是不知是否准确。请大家指点。
是不是因为F0代敲除鼠是嵌合体，所以需要做回交？
怎么做回交？
做完回交后的老鼠是不是就是纯背景的老鼠了，他们的后代的每个基因的表型（如毛色
，眼睛颜色）理论上是一模一样的（除被敲除的基因所在的染色体上的基因） |
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D*a
发帖数: 6830 | 8 嵌合鼠的“不纯”和需要回交的老鼠的不纯不是一个概念。
在基因敲除老鼠中，一般把做过基因修饰的胚胎干细胞注射到小鼠的完整胚胎中，借助
小鼠的完整胚胎进行发育。这个过程中为了区分外源胚胎干细胞和受体小鼠细胞，一般
采用两种花色的老鼠比如agouti色的129老鼠注入到黑色B6老鼠中，这样出来的是嵌合
鼠，它的每个细胞都是纯合的，或者是129纯合，或者是B6纯合，但是老鼠全身因为含
有两种品系的老鼠细胞，所以总体上不是“纯系”。
这样的老鼠，理论上生殖系统也会有这两种品系的细胞构成，因此，跟129交配，生出
来的或者是杂合的129-B6的老鼠（不带有转基因），或者是纯合的129老鼠（带有转基
因）。
做回交的老鼠，是比如上面我拿到了纯合129的转基因老鼠，我希望研究这个基因在C3H
这个品系上的应用，那么我用纯的129老鼠和C3H老鼠交配，这样的老鼠出来的每个细胞
都是不纯的，因为每个细胞都含有一条C3H的染色体和一条129的染色体。然后这样的第
一代老鼠F1继续跟C3H老鼠交配，第二代老鼠就含有多一点C3H(大约75%)，少一点129。
循环往复跟C3H老鼠交配，129越来越少，直到达到纯... 阅读全帖 |
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g******u
发帖数: 66 | 10 最近被一个问题困扰着:
用某种通道蛋白的抗体(通过Western blot和immunohistochemistry) 来研究此蛋白在
一个组织中的表达情况.在大批量的实验前,先做了个预实验测试了下此抗体的特异性.
很奇怪的是,Western blot和immunohistochemistry 都显示在此蛋白完全敲除的动物组
织中还是有弱的阳性表达(和wild-type相比是很弱,但还是能看到非常弱的条带或者染
色).
难道是一抗或者二抗的浓度过大?还是封闭的不够?
注: 1. 此抗体已经有几篇发表的文章显示是特异性的
2. 基因敲除的动物应该没有问题
3. 弱的阳性表达应该不是来自自发荧光或者artifact
非常感谢您的建议和分析!!! |
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h******o
发帖数: 9 | 11 非常感谢Dua， 学到不少知识。
现在的问题是：我的基因敲除老鼠生的小老鼠有黑色也有灰色，而且两种颜色的老鼠都
有（+/-）基因型（这是不是说明被敲除的基因和毛色基因不在同一条染色体上）。现
在不敢继续用他们做实验了，担心不是纯的，难道还要我做10代的回交？那可得1-2年
呀。
有没有其他人也遇到过这种情况，请大家帮忙解释一下。 |
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L*****t
发帖数: 56 | 12 想要研究某个蛋白的功能，HepG2里有这个蛋白完整的代谢通路但是这个蛋白本身也有
表达。现在想敲除本底表达后用Flp-FRT引入突变体。只是单纯的敲除，TALEN和CRISPR
哪一个更合适？ |
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m**********s
发帖数: 4 | 13 请教版上的大神们，在SAGE® Labs（Sigma Advanced Genetic Engineering Labs
）、Applied StemCell、Transposagen 定制基因敲除大鼠和条件性基因敲除大鼠分别
多少钱，如果定制转基因大鼠的话，多少钱啊？谢谢大家 |
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s*********y
发帖数: 579 | 14 K14是表达在基底细胞，也即通常说的皮肤干细胞，一旦发生敲除就永久敲除，皮肤干
细胞理论上不会丢失，所以不存在4周以后就没有了的问题。
请问 toptip 这个有文献支持吗？ |
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v********e
发帖数: 1597 | 15 已完成用韩春雨在自然生物技术所报道的NgAGO做基因敲除的实验，按照韩春雨提供的
Genbank号找到了序列，做了密码子优化，在蛋白N端加了V5标签，C端加了SV40核定位
信号，全基因合成了这个蛋白的基因序列克隆到了lenti病毒载体，用包装的病毒转导
了A549细胞，可以检测到蛋白表达，克隆了转导细胞拿到了稳定表达NgAgo的细胞系，
按照韩春雨文章中列出的方法设计了一对gDNA 靶向基因RNASEL的起始密码子区域，10
倍于韩春雨所示DNA的量转染细胞，48小时后克隆转染细胞，一共筛选了36个克隆，未
见到任何RNASEL敲除的表型，大家看着办吧，我做不出来 |
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a*******g
发帖数: 33 | 16 是lysm cre吗？有效果不佳的，可能跟蛋白本身half life太长有关。其他的原因比如
，flox设计不合理，导致部分敲除，其余部分蛋白还能表达；被敲除片段过长，形成
episome。也可能产生了变化，但是变化比较小， wb要细心一点定量 |
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D*a
发帖数: 6830 | 17 比如说在肌肉里面敲除了但是在血管里面没有敲除？ |
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发帖数: 1 | 18 有个千老告诉我。actin敲除的斑马鱼吃起来嫩,转氨酶高的斑马鱼吃起来鲜。
一次油炸200条,加点老干妈拌饭。 |
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m********5
发帖数: 17667 | 19 方舟子观点让我非常意外
以前有人责怪他是主要反华，假的打假，我还表示怀疑
这次事情，我发现他一反常态啊，CCR5敲除有危险？这尼玛有什么明确证据？CCR5缺失
做了几万年临床都没问题，怎么就有风险了？按他平时说的，转基因不是没有明确证据
说危险就是安全么...
悲剧 |
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m********5
发帖数: 17667 | 20 CCR5敲除怎么就不稳妥？
那么多人本来就CCR5缺失
你们的论证从最开始就站不住脚 |
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发帖数: 1 | 23 最大问题是vero e6 cells是老鼠细胞，老鼠是不感染新冠的
而第二个转染了hACE的人细胞系，野生型比敲除PRRA的侵入能力要略强
这文章不严谨，有问题 |
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a*******g
发帖数: 33 | 24 辛辛苦苦弄了一年，打算在老鼠身上用lysM-Cre敲除一个floxed的基因，结果酶活
性没怎么变化，蛋白含量变化也不到50％，mRNA倒是减少了80－90％。我觉得是很失败
，没法继续干下去了。可是老板一直不接受失败。即便失败，也要我去探讨为什么失败。
博士刚开始，碰到这种事，大家说说该怎么办呢？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 25 这个，虽然我并不是专业做这个autism的，但是我也必须指出说，
临床数据里面的关于基因和疾病的关系一般不能作为直接证据的，顶多只能说是
有关联。在老鼠里面作敲除或者其他处理才是比较直接的证据之一。
这篇文章的意义(我认为是相当重要的意义）就是给领域里面的人往下追踪
这个蛋白提供了一个非常重要的支持证据
另外，虽然人类autism 疾病里面直接含有这个shank3突变的人其实很少，
但是考虑到其他的一些突变可能是通过这个途径的来起作用的，还有很多
非基因型的因素（比方说heat shock, chemical stress etc) 可以在不依赖于
突变的情况下影响到基因的表型，其实在真实意义上这个shank3 所包含的case
的比例可能远远大于这个1%。
如果我是这个领域里面的话，下一步更重要的做法就是把这个shank3 进行
inducible KO, or stage-specific KO, 看看这个蛋白是否真的在幼年时候
大脑发育的时候起作用。因为大部分autism 病人出现症状的时期都是幼年期，
在青春期之前。 |
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L*****o
发帖数: 48 | 26 从转基因小鼠里提取了一些primary cell，准备做一些细胞实验。想请问一下，可以直
接加soluble Cre敲除带有lox-P的细胞吗？还是应该用adeno-cre transfect?多谢！ |
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l**********1
发帖数: 5204 | 27 老大或你老板 能开发个Array knock out tool that can parallel 敲除任意N (N>2) N个基因 at E coli
next Yeast, fly, zebrafish, especially on Rat Mice Human at universal biomedical reactions pathway middle
point. then 这里的千老就能成墙街矿工或湾区龟公的生路喽
而你和你老板可以炸药奖或被至少被那个奖提名
of course, might should be done at Biosafety level P4 areas. -- not joke, Sure!
//en.wikipedia.org/wiki/Biosafety_level#Biosafety_level.C2.A04
Cm |
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l**********1
发帖数: 5204 | 28 是啊 违反 以下的游戏理论 控制 的可能性 很大阿
2002 Nature paper E coli 多样性 石头 剪刀 布 的 游戏理论 控制
E coli 扩散表面积 和 E coli的多样性成反比
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12110887
then just one question:
你那种省事的两个一起敲除 和 E coli 扩散表面积 操作 哪一种 对biodiversity 的影响更大啊?
might be a idea for later proposal. |
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q*****d
发帖数: 445 | 29 谁有简单易行的方法，需要敲除很多基因，一个个的来还不累死人!这方法到底有木有
啊，目标菌是Saccharomyces cerevisiae.谢谢！ |
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D*a
发帖数: 6830 | 30 啊。。。理论上细胞之间不会交换的吧。。被敲除的基因和毛色基因在不在同一条染色
体上，一个精子也只能最终追溯到一个细胞而来而不是两个细胞，所以精子应该是纯合
细胞。
你能不能详细说说你用的各种老鼠的background和毛色显隐性。。。是不是你ES毛色基
因本来就不是纯合的。。。 |
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h******o
发帖数: 9 | 31 我看了些用基因敲除鼠发表的文章，很多都没有写明回交了多少代呀。 |
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b*****o
发帖数: 150 | 32 就是这个道理，这是很正常的。有时候做KO的人没有考虑到去掉EXON后前面和后门的
EXONS还能连在一起。就是碱基数是３的倍数（IN FRAME）。如果是这样的话，有些功
能蛋白去掉一些片段仍然有功能，尽管功能会降低。如果要KO的蛋白功能研究的非常清
楚，这时就要敲除关键的蛋白片段对应的EXON。
domain |
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s*****g
发帖数: 87 | 33 用TALEN吧，敲除单个基因的话CRISPR没有优势，而且还可能有off-target |
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l**********1
发帖数: 5204 | 34 Mark again and thx.
--from FDU Alumni
发信人: giantbird05 (大鸟), 信区: Biology
标 题: Re: 想在HepG2细胞系里敲除一个基因，用TALEN还是CRISPR容易？
发信站: BBS 未名空间站 (Sun May 26 01:39:25 2013, 美东)
mark;求科普 |
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W****7
发帖数: 426 | 35 想做个敲除鼠，有好公司推荐么？能说说推荐的理由就更好了。 便宜，快速，高效能
全占最好了，国内的公司也行。谢谢！ |
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s*********y
发帖数: 579 | 36 比传统的方法改进很多了，版上有人做过吗？
我老板说中国的公司会构建好construct，寄到美国，这边的ES细胞部门负责infection
，半年就搞定。
想我当初做条件基因敲除，前后花了好几年。 |
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e**e
发帖数: 166 | 37 想定一个哺乳动物细胞的基因敲除的cell line。
如题。 谢谢。 |
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b*****n
发帖数: 1841 | 38
不太理解你这句话的具体意思：
如果是不在你要研究的组织中表达，那就不能用；
如果是说除了要研究的组织外在其它组织也有表达，那比全身敲除还是要好很多，如果
其它组织的发育等不影响要研究的组织，那就基本上没有关系。
找南京模式动物中心或其它能搞定海关专业公司，引进费用两三万，时间至少两三个月
，包括回国后隔离一个月。 |
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h******7
发帖数: 22 | 39 除了要研究的组织外，在卵巢和下丘脑也有表达。这是现成jlab有卖的。如果不行，如
何自己设计只有要研究的组织only表达的cre工具鼠啊？
请问，jaskson lab没有定制条件性敲除鼠的业务么？ |
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D*a
发帖数: 6830 | 40 多不多要看一次剂量，其实单次剂量小点，还是五天效果好于短点大剂量
tam注射进去就进肝脏代谢了，皮肤敲除还是通过血管到皮肤的，并不是抹在皮肤的，
不需要用4oh-tam |
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发帖数: 1 | 41 genotyping PCR 结果是对的，但是WB结果显示目的基因没有被敲除
会是什么原因？ |
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s*******1
发帖数: 188 | 42 看到一些文章用RT-PCR来验证CRISPR/CAS9敲除基因效率，而有的文章则展示测序结果
来证明。
请问对于这两种方法哪种更好？
CRISPRi是RT-PCR，CRISPR KO则用测序？ |
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n***g
发帖数: 5027 | 43 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: nanog (大家好), 信区: Biology
标 题: 【包子】怎么用FLP-FRT系统同时敲掉两个抗性基因？
发信站: BBS 未名空间站 (Wed Nov 11 18:57:39 2015, 美东)
同时还不会敲掉靶向基因呢？
比如 FRT-neoR-FRT-GENE A-FRT-puroR-FRT，这样的话用flippase处理的话，gene A也
会被敲除吧？
另外，FRT的sequence，就在抗性基因两侧加上5'
GAAGTTCCTATTCtctagaaaGtATAGGAACTTC3'，是不是就可以了？
谢谢大家 |
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发帖数: 1 | 44
应为你组织不纯，里面是个mixture， 其实敲出了，没有敲出掩盖你敲出效率 |
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z***o
发帖数: 1254 | 45 都说了有比编辑基因更好的多，稳妥的多的办法避免母婴传染，这厮还偏这么干，明摆
着想出名想疯了。而且他不能证明敲掉CCR5孩子就此能免疫HIV了。也不能证明这么操
作不会引发其他更大的危害。丫甚至不能保证或证明是不是敲掉的是CCR5而不是其他基
因。这是谋杀。 |
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t********h
发帖数: 456 | 46 1.CCR5对白人和黄种人的作用有何不同并不清楚
2. 目前技术脱靶率高，无法保证敲掉其他基因，或者使得CCR5附近其他基因不受损
3.就是敲掉CRR5，也难以免疫中国的艾滋病亚种，只能部分免疫欧洲亚种 |
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c******g
发帖数: 2323 | 47 用艾滋病的噱头确实sb，艾滋病现在都不算个事，没必要这么搞，都不如弄个先天性心
脏病什么的来敲一敲，或者什么其他弄死婴儿的病，这波炒作给差评，以后要是出了什
么乱子，这个sb肯定是背锅的，估计的凌迟 |
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d*********o
发帖数: 6388 | 48 https://www.cell.com/pb-assets/journals/research/cell/Cell_S0092-8674(20)
30262-2.pdf
子陵在听歌
Cell出版社preprint了华盛顿大学Veesler组关于SARS-CoV-2生化特性和结构生物学的
重要文章。这篇文章十分严谨也十分重要，它同时进行了生化功能研究和结构生物学研
究，给出了更高分辨率的S蛋白三聚体两种状态结构。研究反驳了网络传言如“插入论
”。研究发现不具有“插入RRAR”的病毒S蛋白具有更强的细胞结合能力。因此可以推
论，所谓的“人工合成”病毒，其实本身感染细胞的能力更低。而另一方面，它的部分
结论较McLellan组Science文章更有逻辑。
研究首先通过假病毒融合实验，证明了一个重要结论，就是SARS-CoV-2与SARS-CoV具有
几乎相同的Vero E6细胞受体细胞结合能力，这与McLellan组应用SPR得出的结论不同。
而非常有意思的是，该研究设计了一个突变体，Q677TILR SV683，这个突变体敲除了饱
受争议的4个插入氨基酸序列RRAR和furin切割位点。... 阅读全帖 |
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g*********5
发帖数: 2533 | 49 看到感兴趣的一些老鼠，gene trap敲掉了与我目前研究蛋白相互作用的基因。
但是我的这个基因如果全敲出后，胚胎只能活10天。。
所以担心如果把这些老鼠买来，仍然拿不到纯合子
正在犹豫买不买。。。 |
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n***g
发帖数: 5027 | 50 同时还不会敲掉靶向基因呢？
比如 FRT-neoR-FRT-GENE A-FRT-puroR-FRT，这样的话用flippase处理的话，gene A也
会被敲除吧？
另外，FRT的sequence，就在抗性基因两侧加上5'
GAAGTTCCTATTCtctagaaaGtATAGGAACTTC3'，是不是就可以了？
谢谢大家 |
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