s****r
发帖数: 251 | 1 我也纠正一下你对毒品的偏见。免得正常人被你“纠正”坏了。
你是不是懂得海洛因和可卡因上瘾的道理？懂不懂上瘾后欲罢不能？你说得对量小的时
候这些东西都没有问题。实际上氰化钾量小的时候也没有问题，只要对cytochrome c氧
化酶的抑制程度没有导致线粒体的质子梯度下降，ATP不能生产。
大家说毒品的时候都是指上瘾的剂量纯化或部分纯化的毒品使用。这些毒品引起的极度
愉悦感本事就是在反馈、改变大脑神经受体。比如海洛因改变opiod receptors，可卡
因改变dopamine receptors，尼古丁改变nicotinic receptors。酒精可能影响多重受
体，比如GABA受体。这些都是神经递质的受体。可以改变人的情绪，对外界的感受。
不懂，就不要碰。没有办法了要用，比如止痛，问医生。 |
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d********f
发帖数: 43471 | 2 用大便造肉来吃，你能接受吗？最近，日本的科学家在研究如何处理生活污水中的粪便
时，搞出了这个令全世界都震惊的解决方案。据说，这种屎造肉的蛋白质含量还相当高
呢。记者采访武警医院营养科副主任曾晶，对这另类处理方法，她从专业角度进行了分
析。
策划：赵洁 撰文：李文
图片：gettyimages(除署名外)
几点疑问
这种“肉”蛋白含量高但是否优质蛋白？
这种“肉”能否经得起烹饪？
这种“肉”里氨基酸的配比是怎样的？
它跟鸡蛋比，营养又如何？
如果它根本就远不如鸡蛋，我们为啥要劳心
劳力去开发它作为高蛋白食物的功能呢？
“蛋白质含量高”的猫腻
“屎造肉”吸引眼球的一点，是它蛋白质含量很高，达到63%。曾晶举了几个日常富含
蛋白质的食品的例子：“猪肉的蛋白质含量是17%～18%，鱼肉20%，鸡肉蛋白质含量约
为22%～23%，鸡蛋在11%～12%。干
黄豆中的蛋白质含量在36%左右。单从数据来看，这些传统食品确实在蛋白质含量上还
不如这种屎造肉。市面上有的蛋白粉甚至都达不到它的水平。”但是，曾晶也指出，例
如除掉水分的肉松、牛肉干，就比原本的猪肉、牛肉“蛋白质含量高”，含量高并不一
定意味着... 阅读全帖 |
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b*****d
发帖数: 7166 | 3 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: Lurker (@Zerg), 信区: Military
标 题: 北京小学生创新比赛项目名单，跪了!
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Dec 3 22:57:26 2013, 美东)
引自 http://www.acfun.tv/v/ac334765
第32届安捷伦北京青少年科技创新大赛学生科技创新项目公示名单(up节选)
小学组
论翼龙骨骼结构与灭绝原因的联系 魏博琨 洪瑞怡
负压式医用手套自动佩戴装置 米尔莉 张苏潼
双轴自稳云台 钱李潜馨 小学六年级
香烟浸出液对春羽介壳虫的防治实验 肖雨涵 小学四年级
北极斯瓦尔巴德群岛朗伊尔宾I号冰川不同海拔梯度环境对北极罂粟生长的影响
白宇辰 小学六年级
铬污染建筑粉碎颗粒大小对铬含量测定的影响 陈博伦 小学六年级
超声波汽车开门自动防刮蹭装置 王默涵 刘芃青
基于AVR单片机的中小... 阅读全帖 |
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s***r
发帖数: 4013 | 4 发信人: mashall (~奇思妙想聪明的小羊~), 信区: Joke
标 题: 安捷伦！ shame on you！
发信站: 水木社区 (Wed Dec 4 09:06:33 2013), 站内
【 以下文字转载自 NewExpress 讨论区 】
发信人: relic (遗迹), 信区: NewExpress
标 题: 安捷伦！ shame on you！
发信站: 水木社区 (Tue Dec 3 23:32:52 2013), 站内
引自：http://www.acfun.tv/v/ac334765
第32届安捷伦北京青少年科技创新大赛学生科技创新项目公示名单(up节选)
小学组
论翼龙骨骼结构与灭绝原因的联系 魏博琨 洪瑞怡
负压式医用手套自动佩戴装置 米尔莉 张苏潼
双轴自稳云台 钱李潜馨 小学六年级
香烟浸出液对春羽介壳虫的防治实验 肖雨涵 小学四年级
北极斯瓦尔巴德群岛朗伊尔宾I号冰川不同海拔梯度环境对北极罂粟生长的影响
白宇辰 ... 阅读全帖 |
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w**********5
发帖数: 1741 | 5 第32届安捷伦北京青少年科技创新大赛学生科技创新项目公示名单(up节选)
up:天朝的中小学生太威武了，十年内必夺诺贝尔奖，百年内一统全球。我看到了祖国
的未来与希望。up表示大学白读了，很多题目看都看不懂。某些医药学，植物学，化工
材料和工程的内容非常碉堡,部分非医药化工类异常碉堡的标红了。
各位等着被雷吧。up已经阵亡了。你们能看懂%多少呢？
小学组
序号 项目编号 项目标题 学科分类 类型 组别 成员
年级 学校名称 辅导教师 区县 获奖等级 专项奖
1 LS12012T 论翼龙骨骼结构与灭绝原因的联系 生命科学 集体项目
小学组 魏博琨 洪瑞怡 小学六年级 小学六年级 北京市东城区史家
胡同小学 北京市东城区史家胡同小学 张培华 东城区 1
10 ... 阅读全帖 |
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f**********r
发帖数: 18251 | 6 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: judien (Now we are one!), 信区: Military
标 题: 安捷伦！ shame on you！ (转载)
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Dec 5 01:04:55 2013, 美东)
发信人: relic (遗迹), 信区: NewExpress
标 题: 安捷伦！ shame on you！
发信站: 水木社区 (Tue Dec 3 23:32:52 2013), 站内
引自：http://www.acfun.tv/v/ac334765
第32届安捷伦北京青少年科技创新大赛学生科技创新项目公示名单(up节选)
小学组
论翼龙骨骼结构与灭绝原因的联系 魏博琨 洪瑞怡
负压式医用手套自动佩戴装置 米尔莉 张苏潼
双轴自稳云台 钱李潜馨 小学六年级
香烟浸出液对春羽介壳虫的防治实验 肖雨涵 小学四年级
北极斯瓦尔巴德群岛朗伊尔宾I号冰川不同海拔梯度环境对北... 阅读全帖 |
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h****n
发帖数: 2552 | 7 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: midwestPstD (中西部博士后), 信区: Biology
标 题: 请教CRISPR行家-HDR Template Design
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Nov 18 16:24:10 2014, 美东)
看了Zhang Feng的Nature Protocol关于CRISPR的文章，Figure 6里面的ssDNA
template明显的效率比plasmid作template高。文章并没有明确说明哪个template好。
想了一下，ssDNA分子量比plasmid小多了，同样的ug template, ssDNA的分子数肯定多
多了，也许这是一个解释。
我自己在设计HDR template，想两边各一个Kb的homologous arm,中间有60-70bp 的
mutation insertion。这个两kb的DNA准备克隆到一个plasmid里面，sequencing确定
mutation后，就可以用作HDR template了。
想请教的是：需要把这个两Kb的template从plasmid里... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 8
这个是饶毅考证之后的结果：
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1971年下半年，屠呦呦本人提出用乙醚提取青蒿，其提取物抗疟作用达95%到100%，这
一方法是当时发现青蒿粗提物有效性的关键。1972年3月，屠呦呦在南京“523任务”的
会议上报告这一结果，获得大家注意，但并未成为唯一的重点，会议总结时组织者建议
“鹰爪要尽快测定出化学结构，并继续进行合成的研究；仙鹤草再进一步肯定有效单体
临床效果的基础上，搞清化学结构；青蒿、臭椿等重点药物，在肯定临床效果的同时，
加快开展有效化学成分或单体的分离提取工作”。
其后，屠呦呦研究小组的工作集中于青蒿。倪慕云先试图获得青蒿中的活性化合物，以
后钟裕容成功地获得结晶“青蒿素II”（后称青蒿素），屠呦呦于1974年2月份在中医
研究院召开的青蒿座谈会（中医研究院中药研究所、山东中医药研究所、云南省药物研
究所共同参加）上提到了青蒿素II的分子式。从明确青蒿乙醚中性提取物（黑色胶状物
，抗疟有效组分）的抗疟效果到获得青蒿素（白色针状结晶，抗疟有效单体），从而确
定了抗疟分子。
屠呦呦研究小组成员还与其他研究组合作，其... 阅读全帖 |
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h******e
发帖数: 9616 | 9 【 以下文字转载自 Military 讨论区 】
发信人: DonaldTrump (Make America Great Again!), 信区: Military
标 题: 美帝尿哭！第32届北京青少年科技创新大赛学生科技创新项目名单（节选）
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Jan 17 21:21:25 2016, 美东)
【小学组】
论翼龙骨骼结构与灭绝原因的联系 魏博琨 洪瑞怡
负压式医用手套自动佩戴装置 米尔莉 张苏潼
双轴自稳云台 钱李潜馨 小学六年级
香烟浸出液对春羽介壳虫的防治实验 肖雨涵 小学四年级
北极斯瓦尔巴德群岛朗伊尔宾I号冰川不同海拔梯度环境对北极罂粟生长的影响 白
宇辰 小学六年级
铬污染建筑粉碎颗粒大小对铬含量测定的影响 陈博伦 小学六年级
超声波汽车开门自动防刮蹭装置 王默涵 刘芃青
基于AVR单片机的中小学生坐姿不端提醒仪的设计 韩启沃 小学六年级
太阳黑子对石榴树年轮宽度的影响 邓瑞傲 小学五年级
【中学项目】
槐树中Lectin基因的克隆及其抗虫功能的初步验证 刘佳玉 高二
长白山火山碎屑流的调查研究 刘旺予 初三
土壤表层3,4-苯并... 阅读全帖 |
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S*******s
发帖数: 13043 | 10 这也太过时了吧。现在已经是36届了
第36届北京青少年科技创新大赛【中学生创新项目】获奖名单-未入终评
序号 项目编号 项目标题 学科分类 项目类型 竞赛组别 项目成员 成员年级 学校名称
指导教师 区县 辅导机构 "获奖
等级"
1 SO162048 素质教育背景下基础书法教育现状研究 行为与社会科学 个人项目 初中组
聂楚瑄 初三 北京市第一七一中学 李 昆 赵 彧 王本喆 东城区 二等奖
2 EV162015 不同园林型植物非结构性碳水化合物的生长动态比较 环境科学 个人项目
初中组 耿 畅 初三 北京市第一中学 李 霞 王 彪 东城区 二等奖
3 EV163038 人造沸石对NH4＋的吸附特征研究 环境科学 个人项目 高中组 王光普 高
二 北京市广渠门中学 陈晓玲 黄占斌 陈 浣 东城区 北京市东城区崇文青少年科技馆
,中国矿业大学 二等奖
4 ME162005 关于常用品牌洗涤灵的致突变性的初步探讨 医学与健康学 个人项目 初中
组 高子涵 初二 北京市第二中学分校 路 静 许建宁 东城区 中国疾病预防控制中心
二等奖
5 ME163009 UCHL-1在... 阅读全帖 |
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f*****n
发帖数: 12752 | 11 971 血凤新生
新的部队组建完成，在正式作战前还需要配合磨练，不过前线暂时不算吃紧，克拉亚的
攻略重点放在了市区，变异兽是丧尸的食物，丧尸又何尝不是变异兽的食物？新部队让
黄廷伟将工作重心偏移，而张小强也不需要跑到前线屠杀变异兽，带着血凤孝敬的晶核
与胶质体回到自己的房间。
整整十包胶质体与晶核让张小强很是头疼，如今他总结了一些经验，变异者吃胶质体绝
对会更加厉害，但是现在他没有这么多的手段去控制他们，前线的进化者大多都是剑斩
从市区带出来的血战精锐，对他们的归属感并不强烈，这些人需要很长时间的的调教，
在后方安家立业之后才会定下性子和华夏复兴绑在一起，现在么？张小强不想在他们身
上浪费这些东西。
胡思乱想的张小强一下拉开保险箱，眼珠子顿时瞪了出来，原以为收获了十包胶质体和
晶核保险箱会放不下，那知道……，“碰……。”张小强狠狠地关上保险箱，随即又使
劲儿拉开，却看到保险箱里依旧什么都没有，五级胶质体，四级胶质体，还有三级的，
两级的，一级的全都不在，只有最下面一层散落着百多颗个头很小的晶核，貌似被人看
不上才扔在这里的。
“濯明月……，我跟你势不两立……。”张小强咬牙切齿地嘶吼出来... 阅读全帖 |
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n**t
发帖数: 45 | 12 hehe, just keep a copy here, it's gsafe.
bm never delete our post. |
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n**t
发帖数: 45 | 13 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
【 原文由 royluo 所发表 】
本文献给YL
（十二）Gel filtration的先天缺陷
上一篇讲到核提取物。实验的下一步就是跑Sephacryl S-300 column。
这一步实验是整个课程中第一次跑凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography)，
我感觉还是很激动的。Gel filtration 是色谱中及其重要的一个种类。我先来谈谈
原理把。Gel filtration柱的材料是由高分子聚合物做的微珠。这些微珠呢，并不是
实心的，而是有很多孔状结构。当蛋白质样品经过这些微珠的时候，如果蛋白质分
子体积太大，不能通过微珠的孔状结构，就会绕过微珠，很快的被洗脱下来。如果
蛋白质分子体积不是那么大，可以通过微珠的孔状结构，就会迟一些被洗脱下来。
这样，蛋白质分子可以根据大小而被gel filtration column分开。
Gel filtration 和其他色谱方法一个显著的不同是：Gel filtration 并不依赖
蛋白质分子与柱材料的结合来分离蛋白。这个特点的一个好 |
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B*******a
发帖数: 801 | 14 化工你怎么就忘了大连理工？问题是人家其他专业也很强大。北大，科大，清华华尔街至少每家500校友。科大vp以上据说有200多。更有亿万富豪江平。正牌的科大毕业。
你将来出去就知道了。北大没有化工，可是大牌的公司，北大绝对华理人多。人家分析
，合成，whatever，都比华理强大。
现在出来，搞纯化工的不多，类似结晶这样一个过程的研究，这个算是纯化工。余下什
么搞催化剂，搞养细胞，搞纳米，你说这算什么化工。跟化学比，唯一的优势就是0优
势。基础知识差的很远哪。
再说到出国，搞不过人家就认了，不要说什么资料之类。鸡精那阵子，华理出来的人就
多了？人家擅长的是默默收集信息，长远规划，分门别类的整理，最后一枪搞定。
至于上海好地方，上海是好地方，有本事的人的好地方。女生毕业，不就是给成功海龟
当鸡玩么。【1】
你回去看看你同学，有谁能穿一套又一套的burberry？别的不说，听说过 LA MER吗？大概就知道lancome吧。用的估计还是美加净。都是在大商场里面光看不买的。外带住的特别屁，都是很少能来南京西路走走的。有几个在nikon d3前拍过？有几个是用的起lenovo t61的？
【1】发 |
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发帖数: 1 | 15 ◇◇新语丝(www.xys.org)(newxys.com)(xys10.dxiong.com)◇◇
举报南京大学生命学院院长华子春学术不端
方先生您好！
我们反映南京大学生命学院院长、长江、杰青、 国家科技进步奖获得者、
国重主任华子春长期存在学术不端问题。 附件是我们发现的第一批四组共9篇文
章。
1. 2000-C和2000-E两篇文章皆为英文稿， 分布发表于南京大学学报和
Protein Expression and Purification。华教授是通讯作者。 南京大学学报的
内容系于后者的文字上做了删掉，无文字改写。 例如：
前者的第一、二段：
Human cardiac-specific homeobox protein (hCsx2 or Nkx2.5) encodes
a homeobox transcription factor of 323 amino acids containing six
cysteines and is composed of three domains: the TN-domain, the
homeobox- domain, and t... 阅读全帖 |
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f******r
发帖数: 1105 | 16 作者：科研处 | 添加日期：2010-04-26 | 编辑者：李坚 | 最后修改时间：0000-00-
00 | 点击次数：940
2009年度高等学校科学研究优秀成果奖（科学技术）评审工作日前结束,我校耿信笃教
授主持完成的“蛋白折叠液相色谱法及应用”成果，获得自然科学二等奖。
《蛋白折叠液相色谱法及应用》研究成果属色谱、生物及医药化工领域。蛋白折叠被列
为当今科学上的难题之一，同时也是生物工程下游纯化技术中一个亟待解决的世界性技
术难题。针对这两个难题，耿信笃教授领导的课题组经过长达20年的研究，在理论方面
首次阐明了PFLC对蛋白折叠较完善的分子学机理；在应用方面建立了变性蛋白复性并同
时纯化新工艺和新方法，并研发了新设备和新介质。
本成果共发表代表性研究论文81篇，被SCI收录53篇，共被引用585次，受到国内外同行
专家的高度评价；出版专著2部，都已成为我国研究生教材内容的一部分；并且授权获
得美国和欧洲发明专利各1项，国家发明专利2项。 |
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h*d
发帖数: 19309 | 17 发信人: cic (小壁虎·追求梦想，淡定生活), 信区: TsinghuaCent
标 题: 清华学生攻坚结构生物学难题
发信站: 水木社区 (Tue Oct 19 12:44:38 2010), 站内
http://www.stdaily.com 2010年10月19日 来源： 科技日报 作者： 周襄楠 吕露英
■关键词 —— 大学生科研
以党尚宇、孙林峰、黄永鉴三位清华学生为主力的课题组，在清华大学医学院教授
颜宁的带领下，用了一年半的时间，在世界上首次解析了膜蛋白——大肠杆菌岩藻糖转
运蛋白的结构，并结合生化手段初步揭示了其工作机理。顶级学术期刊《自然》在10月
7日刊发了他们的学术论文《岩藻糖转运蛋白向胞外开放构象的结构》。
膜蛋白的结构生物学研究一直以来是结构生物学领域公认的重点及难点。而该论文
的前两位作者党尚宇和孙林峰在开始课题研究的时候还都是清华大学的本科生。
初生牛犊不惧虎——本科生接手结构生物学世界难题
膜蛋白存在于细胞的细胞膜上，它们是沟通细胞或细胞器内外的桥梁。各种营养物
质的运输，细胞内有毒物质的排出，以及细胞内外信息的交换都要依靠膜蛋白，所以它
们的功能... 阅读全帖 |
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c*****m
发帖数: 16 | 18 欧洲物理学会6月8日致函我校潘建伟教授，授予他2005年度欧洲物理学会菲涅尔奖，以表
彰他在量子态隐形传输、量子纠缠纯化以及多光子纠缠等量子信息实验研究中做出的杰出
贡献。颁奖仪式将于6月14日在德国慕尼黑召开的欧洲量子电子学与量子光学年会
(CLEO/Europe-EQEC)上举行。
潘建伟教授1992年毕业于我校近代物理系，1999年获维也纳大学博士学位。他多年从事量
子信息领域的研究工作，并取得了一系列开创性的研究成果，其主要贡献有：
首次实现量子态隐形传输，量子纠缠互换，三光子、四光子、五光子纠缠，量子纠缠纯化
。其中五光子纠缠实验完全在国内完成，并于去年发表在英国《自然》杂志上。从1998年
以来，潘建伟的上述主要工作已经被他引1700余次。
近几年来，国际量子信息实验领域取得了一系列重大的突破，但是如何解决量子通信距离
短的问题仍然是当今国际上最重要的研究课题之一。潘建伟及其同事下一步的计划之一就
是在这个研究方向上寻求突破，并且已经取得了卓越成绩。今年4月20日，美国《物理评
论快报》发表了潘建伟领导的我校实验小组关于13公里自由空间纠缠光子分发的研究成果
，这一成果为实 |
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r****o
发帖数: 105 | 19 本文献给YL
（三） 不溶的sigma32
四月六号早上，我们开始了第一模块的实验，Burgess教授负责。这老兄研究了一辈子E.Coli的RNA polymerase。E.Coli RNA polymerase 核心酶是一个蛋白质复合体，只有合成RNA的活性，却没有
识别DNA的能力。Sigma系列因子能够识别启动子, 并且与核心酶结合，从而实现转录。我们这个实验
的核心主角就是其中一个因子，叫sigma32。Sigma32可以识别heat shock genes的启动子。Sigma 32
过表达在大肠杆菌里面的时候，绝大部分形成了不溶的包涵体(inclusion body),我们的任务就是要用变性
剂溶解变性不溶的蛋白，然后做重折叠。
所有的buffer几乎都已经配好了，所以直接做就行了。我们先用1% Triton 来溶解细菌本身的一些蛋白，
inclusion body 相当稳定，不溶于triton,所以这一步，绝大部分垃圾就被去掉了。
下一步就是用变性剂来溶解inclusion body。用什么好呢？Burgess教授提到了sarkosyl。sarkosyl(N-十 |
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r****o
发帖数: 105 | 20 本文献给YL
（五）"万金油"buffer
Dr. Burgess 这人特有意思，喜欢吹嘘他发现的小trick。比如，他得意说他是全美国最早用
coomassie blue染蛋白胶的人。据他说，六几年的时候他看到一个澳洲的老兄的一片文章,讲述
一种新奇的染料叫考马市亮蓝, 比当时流行的染料amido black灵敏十倍以上。所以他就写了一
封信要了一些，结果效果奇好。我们听得都目瞪口呆。
不过Burgess最自豪的，还是他的“万金油”buffer。他告诉我们说，他几十年了，总喜欢用这
个buffer的配方，什么蛋白都喜欢这种buffer, 可以说到了包治百病的神奇地步。尽管他吹得神
乎其神，配方却十分简单。这个buffer叫TGE,就是Tris, glycerol 和 EDTA。配方是这样的:
50mM Tris pH 7.9
0.5mM EDTA
50mM NaCl
5% glycerol
Tris EDTA NaCl 这三样都没什么，真正关键的是5%glycerol。有了这个glycero |
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r****o
发帖数: 105 | 21 本文献给YL
（六）兴风作浪的乳糖(lactose)
晚上每天都有人做报告，我觉得让我收获最大的是Bill Studier的报告。本来这个报告是后来才听到的，
但是由于Burgess的模块是唯一的涉及大肠杆菌钟表达蛋白的，我把这一段提前来说说。Studier这老哥是
Brookhaven National Laboratory的，一生研究T7 噬菌体，也是T7 RNA polymerase induction
system(pET 系列质粒)的发明者。
T7 系统在大肠杆菌表达蛋白的应用实在太广泛了，但凡表达蛋白的兄弟姐妹们的不可能不知道这个
系统。长话短说，pET系列的质粒都用T7 promoter来控制基因的表达。T7 promoter只能被T7 RNA
polymerase 识别，而这个咚咚大肠杆菌是没有的。但是有一些溶原菌株,染色体里面已经整合入了由
LacUV promoter和lac operon控制的T7 RNA polymerase 基因片断。如果在细菌培养基里面加入
IPTG, 来诱导T7 RNA polymerase 的表达，就可以启动目的蛋白的表 |
|
r****o
发帖数: 105 | 22 本文献给YL
（八）”液体DEAE“
绕了这么大一圈，现在再回到第一个模块的实验来。前面提到Dr.Burgess要我们
试Gudn HCl溶解sigma32之后的重折叠，结果很糟糕。我们接着试了用sarkosyl做
变性剂的蛋白重折叠。步骤和前一个类似，只是这一次是突然稀释至25倍体积。效果
好了很多，至少没有浑浊现象了。接着我们用Poros HS 50，一种阳离子交换柱，
来把可溶的sigma 分离了出来。为什么这一次用Poros HS 50 而不是前面用的阴离
子交换柱呢？因为sarkosyl带负电，会与阴离子交换柱结合得很好。再加上sigma32
很奇怪，既有负电的表面，又有带正电的表面，所以可以用阳离子交换柱。值得一提
的是绝大部分蛋白质都是偏酸性，所以阴离子交换柱用的比阳离子交换柱频繁得多。
好了，聊完离子交换柱，现在回到Dr Burgess要我们作的另一个很重要的实验。
Sigma32在大肠杆菌过表达的时候，绝大部分都是inclusion body,但是也有一部分
是可溶的。这些可溶的sigma 32可以和细菌体内的Core RNA polymerase结合形
成复 |
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r****o
发帖数: 105 | 23 本文献给YL
（十二）Gel filtration的先天缺陷
上一篇讲到核提取物。实验的下一步就是跑Sephacryl S-300 column。
这一步实验是整个课程中第一次跑凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography)，
我感觉还是很激动的。Gel filtration 是色谱中及其重要的一个种类。我先来谈谈
原理把。Gel filtration柱的材料是由高分子聚合物做的微珠。这些微珠呢，并不是
实心的，而是有很多孔状结构。当蛋白质样品经过这些微珠的时候，如果蛋白质分
子体积太大，不能通过微珠的孔状结构，就会绕过微珠，很快的被洗脱下来。如果
蛋白质分子体积不是那么大，可以通过微珠的孔状结构，就会迟一些被洗脱下来。
这样，蛋白质分子可以根据大小而被gel filtration column分开。
Gel filtration 和其他色谱方法一个显著的不同是：Gel filtration 并不依赖
蛋白质分子与柱材料的结合来分离蛋白。这个特点的一个好处是，所有的蛋白样品
最后都能被洗脱下来，柱子重复用也不会有什么问题。但是这个特点也给 |
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r****o
发帖数: 105 | 24 本文献给YL
（十三）装柱子的学问。
上篇提到了Gel filtration的基本原理，现在谈谈我装柱子的过程。我们用的是Amersham
的 XK26/40的空柱子，然后往里面填充Sephacryl S-300 HR 的resin。按道理说，要提高分辨
率，柱子应该是越长越细才好，这种柱子虽然不短，但是挺粗的。但是一个好处就是，样品体
积可以大一些。
装柱子本身就是一件很tricky的事情，以至与这课的教程上专门列了一小节来解释怎么装
柱子。我们这一组人中，我负责装柱子。一开始就是洗resin了，用粗制烧结玻板过滤的漏斗来
洗，感觉这方法还挺快的。洗完了，就把resin重悬成50%的slurry，然后就是往柱子里头倒了。
但是呢，有一个小窍门，就是必须先封闭柱子的下出口，往柱子里面倒10%体积的buffer。我
过去装柱子犯傻，不知道要这么做，结果发现下面的resin 不均匀不说，还有一大堆气泡。所以
先加buffer是很必要的。倒slurry的时候还得用玻棒引流，这样可以尽可能的避免气泡。然后就
是等了，等resin 沉降３０分钟后，就可以打开柱子的下出液口，让多余 |
|
O******e
发帖数: 4845 | 25 ☆─────────────────────────────────────☆
aspirin (司马不光) 于 (Fri Aug 18 14:36:32 2006) 提到:
从讨论里感觉一个做蛋白结构的课题可以分成四部分，
1是选择作哪个蛋白，或者某个蛋白的哪种突变，
2是纯化和结晶，
3是把衍射图变成结构，
4是解释这个蛋白结构阐释的生物学意义。
从上面的讨论看，第3步似乎是最容易的，有了衍射图一般不至于还解不出结构吧。
第1步和第4步应该是很需要动脑子的，
第4步做得如何直接关系到这个课题的意义有多大，
而第4步的解释似乎也很大程度上取决于第1步选取的蛋白。
第2步我感觉就是不停的变换纯化和结晶条件，直到找出合适的条件为止，
也许这个就是做结构给人感觉只是狂做，不用很多思考的原因吧。
我不是做结构的，说的不对希望做结构的朋友们原谅。
☆─────────────────────────────────────☆
wildsky (我要吃早饭) 于 (Fri Aug 18 14:46:21 2006) 提到:
大部分都对
总的来说就是，做结构的老板很happy， |
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q*****d
发帖数: 445 | 26 Plasmid pYD1-CipA1(3)-EGII was obtained by cotransforming G10A1-HR1, G10A1-
HR2,G10A1-HR3, G10A1-HR4, HisG-EGII, and DrdI/NheI-digested pYD1-
CipA1(3) into EBY100. All plasmids were purified from S. cerevisiae and
thentransformed into DH5a, recovered, and confirmed by DNA sequencing.
以上是我在一篇文章里找到的句子，有两个问题不明白，特来请教：
1.这是不是一种多片段克隆的方法，他是把vector和n个要插入的片段纯化之后不用连
接酶直接转化大肠，这种方法成功率如何？多少个片段都可以吗？
2.他的质粒纯化怎么用酵母呢，有什么优点吗？
谢谢大家，因为我有一堆克隆要做，急需要多片段克隆的方法，一个载体有14个片段要
插入！ |
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c**a
发帖数: 94 | 27 以前没有用过昆虫细胞,现在需要从SF9 细胞里表达蛋白并纯化. 之前试着用
lipofectamine
tranfect细胞, 没有收集到多少蛋白. 请求有经验的高手给个protocol或者方法,用什
么transfection
reagent比较好. 怎么lyse和纯化蛋白. 谢谢了. |
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g*****y
发帖数: 6325 | 28 我纯化的蛋白在dialysis过程中总是有很多沉淀。 纯化的蛋白要做NMR所以好多方法都
不可行。 因为用ion exchange
chromatography, 也不能用高浓度的Nacl. 大家有没有什么建议呢？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 29 抗原没有必要连到bead上。
除非你说的是纯化步骤或者下游其他应用。
但是对于单抗而言，根本不需要用抗原纯化
（因为细胞只产生一种抗体）
用普通的protein A/G bead 就可以了。
我们是用pH3.5 Tris-Glycine 洗下来的。 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 30 我都是在用phosphatase 处理之后，直接用pcr purification kit 把DNA 纯化出来，
或者再跑gel纯化。 你有没有sample3的 control, 比如取5ul sample2, 用水稀释到和
sample 3一样的浓度，看看gel里有没有带，如果没有就是稀释过渡，如果有就是说你
的phosphtase 有contaminate DNAase. |
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c****1
发帖数: 1095 | 31 酶切空质粒确实比较麻烦。我的经验是，一次酶切后，纯化，再酶切，再纯化，再酶切
。三轮过后，基本就没有没切开的了。
其实，插入片段也是个方法，你怕环状DNA跑的快，就插入个大点的片段，这个应该难
度不大。
BTW，为什么要这么大量？让我们开开眼？ |
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A*******e
发帖数: 284 | 32 请问我两个酶有共用buffer，为什么还要分布切呢？ 空质粒双切后直接乙醇沉淀
后做克隆可以吗？ 这样没有背景？我决定切下拉的片断应该也能沉淀下，这样就会有
背景啊。愿闻其祥，请赐教啊。
曾有labmate双切后用PCR纯化试剂盒做回收纯化，一直不成功，我提醒说这样酶切
的片断也能回收回来，不要迷信回收试剂盒，什么多大的片断回收不下来之类的全不可
靠。后来换胶回收就成功了。
NEB
DNA
，-
1- |
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C*******e
发帖数: 4348 | 33 恩,总的来说IDT还是比别的好
不过有些extra purification steps是不是那么好就不好说了,
我又一次需要P32标记primer,订的是HPLC纯化的,
可是标记下来以后发现本身primer就不纯,
应该只有一个大小的,其实有三种不同大小
后来需要标记的primer我就订最普通的desalt的
自己PAGE胶纯化切下来回收
当然如果不是P32标记可能也看不出来其实有三条不同大小的带 |
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i********e
发帖数: 50 | 35
of
非常感谢！请问DLS跟CD是一回事吗？我有未知的纯化样品和已知tetramer的纯化样品
，以前跟老板提过用DLS来做，结果被否决了。他说CD didn't work.我对光学原理真是
一窍不通。DLS是CD？ |
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m*********7
发帖数: 111 | 36 pBluescript SK+ 用BamHI 完全单酶切后,得到的线性DNA片断(约3.0kb，没有用去磷酸
酶处理)用Qiaquick PCR purification kit纯化，纯化后的线性DNA保存在水里，在没
有DNA ligase的情况下，该DNA片断稳定么?会不会自连成环呢?
请大拿们不吝赐教，3x in advance! |
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j*****q
发帖数: 82 | 37 dna是maxi kit纯化出来的。
定了个qiagen的kit，纯化大片段的，看看能回收多少dna |
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p*t
发帖数: 144 | 39 您知道9月份大家为什么质疑那个麻疹疫苗吗？在美国CDC纯化过的疫苗，给1.3亿中国
儿童注射，你放心，俺可不放心，后来卫生部改口说在荷兰做的纯化，为什么改口呢？
不考虑美国（荷兰）因素，而且那个强制注射，有很多科学上的问题，具体可以看寻正
的博客。
风水/宗教/气功信仰者，谁站出来自报一下家门？俺无神论者，也不会气功。 |
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d*e
发帖数: 843 | 40 ●新闻中心记者 周襄楠 吕露英
在清华大学医学院教授颜宁的带领下，以党尚宇、孙林峰、黄永鉴三位清华学生为
主力的课题组，用了一年半的时间，在世界上首次解析了膜蛋白——大肠杆菌岩藻糖（
L-fucose）转运蛋白（FucP）的结构，并结合生化手段初步揭示了其工作机理。顶级学
术期刊《自然》在10月7日刊发了他们的学术论文“Structure of a fucose
transporter in an outward-open conformation”（岩藻糖转运蛋白向胞外开放构象
的结构）。
http://goo.gl/abX6
课题组部分成员合影（从左至右：党尚宇同学、王佳伟博士、颜宁教授、孙林峰同学）
http://goo.gl/nKGS
大肠杆菌岩藻糖转运蛋白结构
膜蛋白的结构生物学研究一直以来是结构生物学领域公认的重点及难点。而该论文
的前两位作者党尚宇和孙林峰在开始课题研究的时候还都是清华大学的本科生。
初生牛犊不惧虎——本科生接手结构生物学世界难题
膜蛋白存在于细胞的细胞膜上，它们是沟通细胞或细胞器内外的桥梁。各种营养物
质的运输，细胞内有毒物质的排出，以及细胞内外信息的交... 阅读全帖 |
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s********2
发帖数: 138 | 41 纯化后，我也跑胶了，条带很单一。所以我一直觉得纯化没有问题，并且产物也很亮。 |
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w***e
发帖数: 269 | 42 蛋白表达和纯化吧，至少需求是稳定的。当然工业界需要的是从small scale(96 well
plate)到large scale(几十到上百升）都熟悉，尤其是large scale对于生产抗体比较
重要而生产抗体是工业界蛋白表达和纯化最重要的一个应用。然后就是 HPLC，MS之类
的技术需求。这类的有经验的硕士比较好找。随便搜搜工业界的工作，80%都是这种。
fresh PhD会这些技术也不好找，但还是比其他的好找一些。 剩下的就是PK,PD的需求
比较多一些。然后好像就比较零星了。 |
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f**u
发帖数: 346 | 43 呵呵，你这样能沉淀下来DNA才奇怪呢。DNA的酒精或者异丙醇沉淀是需要一定的盐浓度
的，常用的是0.3M NaAc。如果盐浓度不够是沉不下来的。你做Maxiprep的时候洗脱的
那一步是高盐洗脱，所以你第一遍沉淀不需要自己加盐，但是当你把沉淀溶解了以后二
次沉淀进一步纯化的时候一定要加盐才行。
另外说一句，你想把DNA里的盐完全去掉从化学上就是不可能的，磷酸骨架上的负电必
须要有正电的阳离子去中和，即使你用水去溶你的沉淀，或者用水从柱子上洗脱DNA，
都免不了有微量的盐。所以更可行的办法是找到一种和你的病毒包装实验compatible的
盐。由于Qiagen的elution buffer里的盐对于有些实验是不好的，所以有时候的确是需
要二次沉淀，不过沉淀前一定要自己调整盐浓度，一般来说加0.1体积的3M NaAc (PH 5
.2)，然后再用1体积异丙醇，或者三体积酒精沉淀。我的经验温度是不重要的。冰箱不
冰箱无所谓。
另外向Maxi这种很麻烦的，建议你离心以后把上清留着，这倒确认最后得到了DNA。另
外对于Maxi，绝对不可能看不到沉淀，你肯定能看到很大很大的沉淀才对，否则肯定是
哪... 阅读全帖 |
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S*****s
发帖数: 287 | 44 何必用 Kit，直接 CsCl 纯化吧。产率高很多，而且样品也很纯。我用 Clontech 的
kit 纯化出来的 BAC，如果再 setup CsCl 的话还能看到有很多杂质和 linear DNA。 |
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s********n
发帖数: 2939 | 45 我大概查了一下，Brown U好像可以做到-150 to 160 C，还有其他几个Universities也
可以做。
有几个问题想请教一下：
1. 文章提到他们的蛋白用N15, C13 label，有的用D2/C13 label，这是两个实验么？
还是说这个蛋白需要用三种标记？
2. 用D2/C13 label的蛋白在纯化过程中用的是普通的水还是D2O?
3. N15/C13 label的蛋白纯化需要用特殊的试剂么？比如说是否需要杜绝带有N14/C12
的试剂？
4. 整个过程如果顺利的话需要多少时间？我在考虑是否值得花这么大的力气去做。
H，靠的是J-
度会慢很多。别
蛋白（寡聚）， |
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C*******e
发帖数: 4348 | 46 对于你说的IDT很不错我要提醒一下
大多数时候IDT很不错
又快又好
不过我说的是一般情况
我自己就遇到过两次从IDT订引物然后很失败的
1.就是上次在版上问的PCR然后TOPO克隆出来以后发现引物5'端位置比设计少了几个nts
，结果造成少
了一个限制性酶切位点；我重新定引物，就好了；
2.是以前做primer extension的时候，因为这个对纯度要求比较高，要统一长度，订的
是要求HPLC
纯化的，结果不要说等了很久，拿到手量也少，等我P32标记以后跑了个胶确认一下，
居然发现有三条
带。从那次以后我做primer extension的时候都是订普通的salt free，买来自己跑个
PAGE胶切下
来纯化一下，又快又便宜。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 47 同意
后来有人问我的话我都会建议PAGE纯化
而不用花HPLC纯化那个冤枉钱以及等待的时间
Bioneer公司记下了，回头去看看
我们这里大多数人用operon的
我一直用IDT
好像IDT在我们附近有个点
我头一天下午比较晚的时候订
也不需要same day的
第二天早晨就到我桌上了 |
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c*********r
发帖数: 1312 | 48 我带的一个小妹，第一年申请没中，part-time在实验室打工，平均每周约30-40小时的
工作时间，周末从没出现过。但大半学期之后从引物设计、PCR、克隆、蛋白表达纯化
、WB一条龙下来都没问题，已经拿到三个纯化的蛋白了。。。期间还参与其它项目和上
课。。。
另一个小弟才二年级，假期基本都在学校，才做实验不到一个学期，但也进步很快。
当然也有做了两个学期也只会做个PCR的。。。
做的好的我会用心培养，自己不上心的我也只好放任自流了。。。
undergraduate |
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X*******0
发帖数: 134 | 49 50-80bp的primer,你有没有考虑到这么大引物合成中的错误合成,不完全合成?有没有向
引物合成公司注明要求PAGE纯化?不注明的话公司默认是给你脱盐纯化,错误产物也混在
里面.你这么长的primer,里面可能有大比例的错误引物,必然杯具啊
80bp |
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