c**a
发帖数: 94 | 1 his tagged 的蛋白用nickel resin纯化出来,在elution buffer里, buffer里有
imidazole, sodium
phosphate. 一共1ml. 以后需要做activity asssy, 请问怎么保存才能不失活性?
是不是要加protease inhibitors, glycerol? 加多少glycerol? 冻-20还是-80? | l*******k
发帖数: 361 | 2 先透析，去掉imidazole， glycerol 5-10%, protease inhibitor不是必须的，可以加
一点EDTA, 1mM, 绝大部分serine protease没有Mg离子都没有活性了，有的蛋白要加DTT或者beta mecapitalmethanol,保持溶液的还原状态，视情况而定。
然后分装，用液氮进行迅速冷却，然后保存在-80, 有些比较脆弱的蛋白即使这样保存也会失活，那就需要找到合适的buffer，或者每次都用fresh made的蛋白
推荐你去读一下一个科大师兄写的从纯化到星辰，里面提到了很多蛋白提纯跟保存的技
术，对于做蛋白的很有帮助 | s*******y
发帖数: 2366 | 3
这个帖子在哪里啊
【在 l*******k 的大作中提到】
: 先透析，去掉imidazole， glycerol 5-10%, protease inhibitor不是必须的，可以加
: 一点EDTA, 1mM, 绝大部分serine protease没有Mg离子都没有活性了，有的蛋白要加DTT或者beta mecapitalmethanol,保持溶液的还原状态，视情况而定。
: 然后分装，用液氮进行迅速冷却，然后保存在-80, 有些比较脆弱的蛋白即使这样保存也会失活，那就需要找到合适的buffer，或者每次都用fresh made的蛋白
: 推荐你去读一下一个科大师兄写的从纯化到星辰，里面提到了很多蛋白提纯跟保存的技
: 术，对于做蛋白的很有帮助
| l*******k
发帖数: 361 | 4 搜一下这个名字就能找到下载了，如果找不到，可以留给我你的信箱，我晚上回家发给
你 | p*****m
发帖数: 7030 | 5 精华区 网友文集 royluo
【在 s*******y 的大作中提到】
:
: 这个帖子在哪里啊
| s*******y
发帖数: 2366 | 6 谢谢~
【在 l*******k 的大作中提到】
: 搜一下这个名字就能找到下载了，如果找不到，可以留给我你的信箱，我晚上回家发给
: 你
| s*******y
发帖数: 2366 | 7 谢谢，看到了，就是排版有点乱……
【在 p*****m 的大作中提到】
: 精华区 网友文集 royluo
| l*******k
发帖数: 361 | 8 我有个电子版的，晚上回家找给你，话说当年来美国，这个师兄还是帮了很大的忙 | s*******y
发帖数: 2366 | 9 非常感谢，站内pm了
【在 l*******k 的大作中提到】
: 我有个电子版的，晚上回家找给你，话说当年来美国，这个师兄还是帮了很大的忙
| a****k
发帖数: 1130 | 10 偶来补充自己的看法吧：透析不是必须的，只要imidazole不影响activity就好。一般
不用再加protease inhibitor，因为细胞裂解的时候不是已经加过了吗。不建议加EDTA
，不知道lz是要做什么activity assay，很有可能这个蛋白本身自己就是需要镁离子的。
glycerol，对于一般的蛋白我们都是加10%，然后分装后用液氮冻完存在－80度。但是
碰到很不好保存的蛋白，比如冻了一两个月就没有activity的，把glycerol加到20％会
有帮助。
DTT或者beta mecapitalmethanol,保持溶液的还原状态，视情况而定。
存也会失活，那就需要找到合适的buffer，或者每次都用fresh made的蛋白
【在 l*******k 的大作中提到】
: 先透析，去掉imidazole， glycerol 5-10%, protease inhibitor不是必须的，可以加
: 一点EDTA, 1mM, 绝大部分serine protease没有Mg离子都没有活性了，有的蛋白要加DTT或者beta mecapitalmethanol,保持溶液的还原状态，视情况而定。
: 然后分装，用液氮进行迅速冷却，然后保存在-80, 有些比较脆弱的蛋白即使这样保存也会失活，那就需要找到合适的buffer，或者每次都用fresh made的蛋白
: 推荐你去读一下一个科大师兄写的从纯化到星辰，里面提到了很多蛋白提纯跟保存的技
: 术，对于做蛋白的很有帮助
| c**a
发帖数: 94 | 11 谢谢大家, fresh的蛋白还在elution buffer里时 就做过activity assay, imidazole不影响活性. 放4度
一个星期之后蛋白就不行了. 所以想存在低温下.
回头拜读一下从纯化到星辰. | k*********n
发帖数: 241 | | s********n
发帖数: 2939 | 13 能发给我一份电子版的么？Thanks!
【在 l*******k 的大作中提到】
: 我有个电子版的，晚上回家找给你，话说当年来美国，这个师兄还是帮了很大的忙
| r*******i
发帖数: 112 | 14 glycerol 是蛋白稳定剂（因蛋白而异）并能保护蛋白在急冻时候少受破坏 >=5%才有用
imidazole 是弱的denaturant, 很多蛋白不喜欢
EDTA 是金属chelator, 如果你的蛋白里没有金属,应该没有伤害,但也没什么用,因为在
提纯中用EDTA 可以抑制金属蛋白酶
很多时候100mM KCl (or NaCl, (NH4)2SO4)with/without 50 mM Arg 增加可溶性和稳
定性, 原理很有争议, 也有用 Arg + Asp
最后, 浓缩,离心,分装,急冻 (N2 liquid), -80
or 50%glycerol -20 |
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