C*******e
发帖数: 4348 | 1 Qiagen Mini Prep很好用
可是Midi Kit我用过很多次了，没有哪次能成功的
提出来的量如果计算ng DNA/ml culture的话比Mini Kit少了近10倍啊
搞得我还不如Mini提好多，然后乙醇沉淀呢
可是每次看到有Midi Kit放在那里闲置，又会觉得是不是该物尽其用
版上经常用Midi Kit的来说说有没有什么trick？
我是严格按照protocol做的 |
R*****w
发帖数: 447 | 2 不会吧。肯定是哪里弄错了。
我用了很多，觉得最初几步特别重要。
1。加入P1后一定要充分混匀，光votex有时不行，还得反复吹打,知道看不见任何颗粒
状的东西
2. 加入P2后摇匀，变成均匀的蓝色，一般比较粘稠
3. 加入P3不要混的太猛（千万别Votex)，晃动几下，又变成白色。（如果摇的太猛容
易堵住过滤的管子） |
C*******e
发帖数: 4348 | 3 我就是这么做的啊，但是Mini的时候很好用，Midi的时候怎么都不行
【在 R*****w 的大作中提到】
: 不会吧。肯定是哪里弄错了。
: 我用了很多，觉得最初几步特别重要。
: 1。加入P1后一定要充分混匀，光votex有时不行，还得反复吹打,知道看不见任何颗粒
: 状的东西
: 2. 加入P2后摇匀，变成均匀的蓝色，一般比较粘稠
: 3. 加入P3不要混的太猛（千万别Votex)，晃动几下，又变成白色。（如果摇的太猛容
: 易堵住过滤的管子）
|
v***a
发帖数: 1242 | 4 我也是严格按照manual
觉得挺好
至今还木发现问题
【在 C*******e 的大作中提到】
: Qiagen Mini Prep很好用
: 可是Midi Kit我用过很多次了，没有哪次能成功的
: 提出来的量如果计算ng DNA/ml culture的话比Mini Kit少了近10倍啊
: 搞得我还不如Mini提好多，然后乙醇沉淀呢
: 可是每次看到有Midi Kit放在那里闲置，又会觉得是不是该物尽其用
: 版上经常用Midi Kit的来说说有没有什么trick？
: 我是严格按照protocol做的
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o**i
发帖数: 1165 | 5 isopropanal 沉淀 离心以后 你能否看见DNA pellet？
如果没有 加入isop以后要震荡混匀 不能简单摇摇了事
用kit提质粒 出不来还真不多见啊
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我就是这么做的啊，但是Mini的时候很好用，Midi的时候怎么都不行
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C*******e
发帖数: 4348 | 6 唉，被鄙视了～
可是MINI用的就是好的啊
而且我们实验室另外一个博后也一样
我们两个一致认为MIDI Kit sucks
Isopropanal沉淀以后看不到pellet
我确信要均匀了，绝对均匀，虽然没有震荡
然后因为没有pellet（我知道哪边冲上）
每次都是用EB一遍一遍吹洗管壁，吹洗那“看不见的”DNA pellet
BTW，我这一步用的玻璃试管
会有关系么？
【在 o**i 的大作中提到】
: isopropanal 沉淀 离心以后 你能否看见DNA pellet？
: 如果没有 加入isop以后要震荡混匀 不能简单摇摇了事
: 用kit提质粒 出不来还真不多见啊
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o**i
发帖数: 1165 | 7 没辙 那你只能把每步的sample收集跑胶了
【在 C*******e 的大作中提到】
: 唉，被鄙视了～
: 可是MINI用的就是好的啊
: 而且我们实验室另外一个博后也一样
: 我们两个一致认为MIDI Kit sucks
: Isopropanal沉淀以后看不到pellet
: 我确信要均匀了，绝对均匀，虽然没有震荡
: 然后因为没有pellet（我知道哪边冲上）
: 每次都是用EB一遍一遍吹洗管壁，吹洗那“看不见的”DNA pellet
: BTW，我这一步用的玻璃试管
: 会有关系么？
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C*******e
发帖数: 4348 | |
a********k
发帖数: 2273 | 9 除了有一次最后一步把溶液洒了，其他时候都挺好
【在 C*******e 的大作中提到】
: 版上除了我没有人用Midi Kit有问题么？
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C*******e
发帖数: 4348 | 10 奇怪了，难道是试剂过期了？
不是我一个人的问题，实验室另外一个博后也用过，一样的结果 |
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R*****w
发帖数: 447 | 11 把别人的试剂（知道肯定行的）借过来，自己再做一次。用试剂盒出不来还真是怪事。
要不就是你的细菌有问题，换个质粒试一下。这种情况我也遇到过几次，有时同时提的
几个质粒有的有，有的啥都没有。重新转化其他感受态细胞，再提又有了。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 奇怪了，难道是试剂过期了？
: 不是我一个人的问题，实验室另外一个博后也用过，一样的结果
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R*****w
发帖数: 447 | 12 mini你也用P1,P2,P3的吗？
QIAGEN有种QuickLyse Miniprep Kit比这种快多了。我强烈推荐这种Mini kit。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 我就是这么做的啊，但是Mini的时候很好用，Midi的时候怎么都不行
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C*******e
发帖数: 4348 | 13 ....我原帖都写清楚了吧，mini的很好用，midi的不行
都是P1,P2,N3
本来是因为质粒是low copy number，mini提，3ml只出来10ng/ul*30ul，
所以改用midi，不是现买的，以前实验室走了的人留下来的，但是P1,P2,我用的是Mini的
但是这样提50ml也只出来20ng/ul*100ul的样子
所以一气之下以后都是mini小提好几个，然后乙醇沉淀
就是很疑惑为什么mini好使，midi不好使，所以上来问问大家
另外现在实验室里没有谁midi用起来提得效果好的，都跟我一样的困惑，为什么mini好
用midi不好用
【在 R*****w 的大作中提到】
: mini你也用P1,P2,P3的吗？
: QIAGEN有种QuickLyse Miniprep Kit比这种快多了。我强烈推荐这种Mini kit。
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s******y
发帖数: 28562 | 14 每100毫升细菌液我一般能提出200~500ng
【在 C*******e 的大作中提到】
: Qiagen Mini Prep很好用
: 可是Midi Kit我用过很多次了，没有哪次能成功的
: 提出来的量如果计算ng DNA/ml culture的话比Mini Kit少了近10倍啊
: 搞得我还不如Mini提好多，然后乙醇沉淀呢
: 可是每次看到有Midi Kit放在那里闲置，又会觉得是不是该物尽其用
: 版上经常用Midi Kit的来说说有没有什么trick？
: 我是严格按照protocol做的
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O******e
发帖数: 4845 | 15 应该是ug吧
【在 s******y 的大作中提到】
: 每100毫升细菌液我一般能提出200~500ng
|
s******y
发帖数: 28562 | 16 啊，对，不小心打错了。呵呵
【在 O******e 的大作中提到】
: 应该是ug吧
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C*******e
发帖数: 4348 | 17 对啊，那个才正常嘛，所以我才来问问为什么midi在我们实验室不work
是不是有什么trick，或者我们忽视了的东西
【在 s******y 的大作中提到】
: 啊，对，不小心打错了。呵呵
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s**********d
发帖数: 1694 | 18 你试过几个plasmids，所有的都这样吗。我一般提10个里面会出现1到2个产量特别低的
，重新转化，或者换不同的e.coli strain。invitrogen有一个叫什么stable之类的
competent cell，据说很好用。 |
o**i
发帖数: 1165 | 19 mini P1 P2 N3
midi or maxi P1 P2 P3 (P3 is cold)
【在 O******e 的大作中提到】
: 应该是ug吧
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C*******e
发帖数: 4348 | 20 P3和N3有什么区别啊？说起来我的P3不是放冰箱的呢，会不会是因为这个？
【在 o**i 的大作中提到】
: mini P1 P2 N3
: midi or maxi P1 P2 P3 (P3 is cold)
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o**i
发帖数: 1165 | 21 duh!
【在 C*******e 的大作中提到】
: P3和N3有什么区别啊？说起来我的P3不是放冰箱的呢，会不会是因为这个？
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C*******e
发帖数: 4348 | 22 3个plasmid用过中提
我不知道和strain会不会有关系
但是我同样的plasmid同样的strain，同一批转化的菌，小提得到的ng DNA/ml culture
就是比中
提的多，这种情况我觉得还是跟kit或者kit的使用比较有关系吧
【在 s**********d 的大作中提到】
: 你试过几个plasmids，所有的都这样吗。我一般提10个里面会出现1到2个产量特别低的
: ，重新转化，或者换不同的e.coli strain。invitrogen有一个叫什么stable之类的
: competent cell，据说很好用。
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s******y
发帖数: 28562 | 23 P3不放冰箱的话，很多蛋白会沉淀不彻底，会有可能堵住柱子，从而导致
plasmid回收率下降
culture
【在 C*******e 的大作中提到】
: 3个plasmid用过中提
: 我不知道和strain会不会有关系
: 但是我同样的plasmid同样的strain，同一批转化的菌，小提得到的ng DNA/ml culture
: 就是比中
: 提的多，这种情况我觉得还是跟kit或者kit的使用比较有关系吧
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j*b
发帖数: 341 | 24 玻璃会吸附DNA？
【在 C*******e 的大作中提到】
: 唉，被鄙视了～
: 可是MINI用的就是好的啊
: 而且我们实验室另外一个博后也一样
: 我们两个一致认为MIDI Kit sucks
: Isopropanal沉淀以后看不到pellet
: 我确信要均匀了，绝对均匀，虽然没有震荡
: 然后因为没有pellet（我知道哪边冲上）
: 每次都是用EB一遍一遍吹洗管壁，吹洗那“看不见的”DNA pellet
: BTW，我这一步用的玻璃试管
: 会有关系么？
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s******y
发帖数: 28562 | 25 啊呀，好像是哦
玻璃一般都是带正电的。
【在 j*b 的大作中提到】
: 玻璃会吸附DNA？
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v***a
发帖数: 1242 | 26 以前听说过有的东西在特定的地方就是不work
看来是你们lab的风水问题。。。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 奇怪了，难道是试剂过期了？
: 不是我一个人的问题，实验室另外一个博后也用过，一样的结果
|
C*******e
发帖数: 4348 | 27 我是隐约记得玻璃会吸附DNA
但是如果用我们实验室的塑料管子，那就什么都看不到了
完全不透明
【在 s******y 的大作中提到】
: 啊呀，好像是哦
: 玻璃一般都是带正电的。
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g*r
发帖数: 2116 | 28 反应体系大 单位产量肯定低呀
【在 C*******e 的大作中提到】
: Qiagen Mini Prep很好用
: 可是Midi Kit我用过很多次了，没有哪次能成功的
: 提出来的量如果计算ng DNA/ml culture的话比Mini Kit少了近10倍啊
: 搞得我还不如Mini提好多，然后乙醇沉淀呢
: 可是每次看到有Midi Kit放在那里闲置，又会觉得是不是该物尽其用
: 版上经常用Midi Kit的来说说有没有什么trick？
: 我是严格按照protocol做的
|
i******m
发帖数: 495 | 29 I use Qiagen maxi and it works perfect.
BTW, I use QIAGEN not Qiafilter
【在 C*******e 的大作中提到】
: Qiagen Mini Prep很好用
: 可是Midi Kit我用过很多次了，没有哪次能成功的
: 提出来的量如果计算ng DNA/ml culture的话比Mini Kit少了近10倍啊
: 搞得我还不如Mini提好多，然后乙醇沉淀呢
: 可是每次看到有Midi Kit放在那里闲置，又会觉得是不是该物尽其用
: 版上经常用Midi Kit的来说说有没有什么trick？
: 我是严格按照protocol做的
|
R*****w
发帖数: 447 | 30 如果一次性培养的细菌取一部分小提，另外一部分大提，小提出来了、大提没出来，才
能说明细菌没问题。
如果小提之后，剩下的菌液再扩大培养，这中间还是有可能有变化。即使小提出来了、
不一定大提肯定有。尤其是如果冰箱放几天后再扩大培养。
如果你不死心就多试几次吧，否则就放弃，用你的小提吧mini, midi, max用了不少，
也只是偶尔提不出来，还没出现过像你一样的。
可能是风水不好。
Mini的
【在 C*******e 的大作中提到】
: ....我原帖都写清楚了吧，mini的很好用，midi的不行
: 都是P1,P2,N3
: 本来是因为质粒是low copy number，mini提，3ml只出来10ng/ul*30ul，
: 所以改用midi，不是现买的，以前实验室走了的人留下来的，但是P1,P2,我用的是Mini的
: 但是这样提50ml也只出来20ng/ul*100ul的样子
: 所以一气之下以后都是mini小提好几个，然后乙醇沉淀
: 就是很疑惑为什么mini好使，midi不好使，所以上来问问大家
: 另外现在实验室里没有谁midi用起来提得效果好的，都跟我一样的困惑，为什么mini好
: 用midi不好用
|
|
|
C*******e
发帖数: 4348 | 31 谢谢提醒！已经放冰箱去了
下次有机会试试
因为瓶子上写15-25度，就没放冰箱
而且以前看别人自己配P1,P2,P3也都是放室温的
所以没想到
【在 s******y 的大作中提到】
: P3不放冰箱的话，很多蛋白会沉淀不彻底，会有可能堵住柱子，从而导致
: plasmid回收率下降
:
: culture
|
v***a
发帖数: 1242 | 32 那你不就是没有严格按照protocol造成的问题
是用之前放4度吧
【在 C*******e 的大作中提到】
: 谢谢提醒！已经放冰箱去了
: 下次有机会试试
: 因为瓶子上写15-25度，就没放冰箱
: 而且以前看别人自己配P1,P2,P3也都是放室温的
: 所以没想到
|
C*******e
发帖数: 4348 | 33 protocol上没有写P3要4度
瓶子上也没有写P3要4度，写的是15-25度
是附录里写P3保存温度15-25度或2-8度
【在 v***a 的大作中提到】
: 那你不就是没有严格按照protocol造成的问题
: 是用之前放4度吧
|
C*******e
发帖数: 4348 | 34 “还没出现过像你一样的”
什么意思嘛
我这不是在这里虚心求教，因为自己也觉得奇怪为什么midi kit不好用，如果那么不好
用，这个产品早
挂了。而且又不是我一个人的问题。我们实验室常规用mini，midi实验室别的成员也说
不好用，所以才
一直闲置的。
【在 R*****w 的大作中提到】
: 如果一次性培养的细菌取一部分小提，另外一部分大提，小提出来了、大提没出来，才
: 能说明细菌没问题。
: 如果小提之后，剩下的菌液再扩大培养，这中间还是有可能有变化。即使小提出来了、
: 不一定大提肯定有。尤其是如果冰箱放几天后再扩大培养。
: 如果你不死心就多试几次吧，否则就放弃，用你的小提吧mini, midi, max用了不少，
: 也只是偶尔提不出来，还没出现过像你一样的。
: 可能是风水不好。
:
: Mini的
|
s**********d
发帖数: 1694 | 35 小抽有东西中抽抽不出来其实很常见，我做了over 50 mutants，用midi很多。重新转
化吧，我就是这么解决问题的。 |
C*******e
发帖数: 4348 | 36 好的，谢谢建议
下次一定记得试一下
【在 s**********d 的大作中提到】
: 小抽有东西中抽抽不出来其实很常见，我做了over 50 mutants，用midi很多。重新转
: 化吧，我就是这么解决问题的。
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r*****m
发帖数: 231 | 37 P3不放冰箱没关系，但用成N3就肯定不行。。。
难道你们整个实验室都没这个常识？
另外mini和midi其实根本没有可比性，column构造差太远了吧。。。不能因为都是
qiagen出的kit就拿来比吧。。。 |
C*******e
发帖数: 4348 | 38 不要一上来就随便鄙视别人行不行
1.midi kit我没用N3，不知道你从哪里看来的；
什么叫“整个实验室都没常识”？！
有实验室常规不用midi，不需要大提，难道很不可思议么
2.谁也没说mini和midi column是一样的
midi出来产量少得不正常，所以问问大家看可能是怎么回事
这样也很奇怪么
【在 r*****m 的大作中提到】
: P3不放冰箱没关系，但用成N3就肯定不行。。。
: 难道你们整个实验室都没这个常识？
: 另外mini和midi其实根本没有可比性，column构造差太远了吧。。。不能因为都是
: qiagen出的kit就拿来比吧。。。
|
r*****m
发帖数: 231 | 39 这里看来的。。。
看来是我老眼昏花了。。。
Mini的
【在 C*******e 的大作中提到】
: ....我原帖都写清楚了吧，mini的很好用，midi的不行
: 都是P1,P2,N3
: 本来是因为质粒是low copy number，mini提，3ml只出来10ng/ul*30ul，
: 所以改用midi，不是现买的，以前实验室走了的人留下来的，但是P1,P2,我用的是Mini的
: 但是这样提50ml也只出来20ng/ul*100ul的样子
: 所以一气之下以后都是mini小提好几个，然后乙醇沉淀
: 就是很疑惑为什么mini好使，midi不好使，所以上来问问大家
: 另外现在实验室里没有谁midi用起来提得效果好的，都跟我一样的困惑，为什么mini好
: 用midi不好用
|
C*******e
发帖数: 4348 | 40 Sorry
那是我没写清楚
我的意思是P1,P2,Neutralization buffer 3
总之P3、N3没有混用
【在 r*****m 的大作中提到】
: 这里看来的。。。
: 看来是我老眼昏花了。。。
:
: Mini的
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F**********6
发帖数: 90 | 41 最关键的一步是沉淀，不要在50ML的大管子里沉淀，我一般把分装到1.5ML管子里沉淀
。然后在70%的酒精清洗这步再集中到一起。这样做，保你万无一失！ |
s******s
发帖数: 13035 | 42 1.首先你要保证你大瓶摇出来的菌和小摇出来的有一样多的质粒，
用大摇的菌取出来小抽一下看看？
2.不放心iso-pro沉淀的时候－70放一个小时先
3.强烈建议用50ml falcon tube做收集离心，干净，pellet清楚
注意速度不要超过6k，可以时间延长一些
Qiagen的Midi简直是最好的plasmid kit, 质粒绝对干净。以前实验
室做transgenic fly, 只有这个做出来的质粒打embryo不会有很高的
致死率
【在 C*******e 的大作中提到】
: Qiagen Mini Prep很好用
: 可是Midi Kit我用过很多次了，没有哪次能成功的
: 提出来的量如果计算ng DNA/ml culture的话比Mini Kit少了近10倍啊
: 搞得我还不如Mini提好多，然后乙醇沉淀呢
: 可是每次看到有Midi Kit放在那里闲置，又会觉得是不是该物尽其用
: 版上经常用Midi Kit的来说说有没有什么trick？
: 我是严格按照protocol做的
|
l******d
发帖数: 2186 | 43 看来是过期了的，上面应该有日期吧
Mini的
【在 C*******e 的大作中提到】
: ....我原帖都写清楚了吧，mini的很好用，midi的不行
: 都是P1,P2,N3
: 本来是因为质粒是low copy number，mini提，3ml只出来10ng/ul*30ul，
: 所以改用midi，不是现买的，以前实验室走了的人留下来的，但是P1,P2,我用的是Mini的
: 但是这样提50ml也只出来20ng/ul*100ul的样子
: 所以一气之下以后都是mini小提好几个，然后乙醇沉淀
: 就是很疑惑为什么mini好使，midi不好使，所以上来问问大家
: 另外现在实验室里没有谁midi用起来提得效果好的，都跟我一样的困惑，为什么mini好
: 用midi不好用
|
C*******e
发帖数: 4348 | 44 非常感谢
你说的tube是这个
还是这个
http://2.bp.blogspot.com/_rbjgqdXMI-Q/Svxno8h8-
iI/AAAAAAAABng/4AoiF9Jht4A/s320/502px-falcon_tubes1.jpg
另外6k g还是6k rpm转多久呢
【在 s******s 的大作中提到】
: 1.首先你要保证你大瓶摇出来的菌和小摇出来的有一样多的质粒，
: 用大摇的菌取出来小抽一下看看？
: 2.不放心iso-pro沉淀的时候－70放一个小时先
: 3.强烈建议用50ml falcon tube做收集离心，干净，pellet清楚
: 注意速度不要超过6k，可以时间延长一些
: Qiagen的Midi简直是最好的plasmid kit, 质粒绝对干净。以前实验
: 室做transgenic fly, 只有这个做出来的质粒打embryo不会有很高的
: 致死率
|
c*o
发帖数: 186 | |
m***o
发帖数: 10232 | 46 先看看质粒是高copy还是低copy,copy高低不同，加入buffer量不同 |
s******s
发帖数: 13035 | 47 第二个。
应该时6k rcf,转到8k会有裂纹，不过不会漏，再高没试过。
大离心机6k这个数量级上大概rcf和rpm差的不多。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 非常感谢
: 你说的tube是这个
: 还是这个
: http://2.bp.blogspot.com/_rbjgqdXMI-Q/Svxno8h8-
: iI/AAAAAAAABng/4AoiF9Jht4A/s320/502px-falcon_tubes1.jpg
: 另外6k g还是6k rpm转多久呢
|
s******s
发帖数: 13035 | 48 最可能的原因时接种方法不对，导致medium里面amp被大量破坏，所以不长质粒。
可以试一下先长到2ml，离心下来然后再接种100－500ml,可能会好很多。
【在 m***o 的大作中提到】
: 先看看质粒是高copy还是低copy,copy高低不同，加入buffer量不同
|
s********x
发帖数: 472 | 49 We met similar problem before, later we foundit by simply using more lysis
buffer, such as triple the quantity would solve the problem.
The lysis process is much less efficient in large system. |
C*******e
发帖数: 4348 | 50 我试的是卡纳抗性的，不是安卞的
不过谢谢提醒
【在 s******s 的大作中提到】
: 最可能的原因时接种方法不对，导致medium里面amp被大量破坏，所以不长质粒。
: 可以试一下先长到2ml，离心下来然后再接种100－500ml,可能会好很多。
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|
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C*******e
发帖数: 4348 | 51 学到了，谢谢！
lysis
【在 s********x 的大作中提到】
: We met similar problem before, later we foundit by simply using more lysis
: buffer, such as triple the quantity would solve the problem.
: The lysis process is much less efficient in large system.
|
s********n
发帖数: 2939 | 52 我用的是QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit，效果很好，P3不用放4度，最后用100-200
ul的EB洗脱，low copy的质粒可以得到大概300-600 ng/ul，不用浓缩。 |
C*******e
发帖数: 4348 | 53 ft，Plus和非Plus的区别是什么啊？
【在 s********n 的大作中提到】
: 我用的是QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit，效果很好，P3不用放4度，最后用100-200
: ul的EB洗脱，low copy的质粒可以得到大概300-600 ng/ul，不用浓缩。
|
s********n
发帖数: 2939 | 54 Protocol比较简单，不用沉淀浓缩。具体的你可以查一下Qiagen的manual。
【在 C*******e 的大作中提到】
: ft，Plus和非Plus的区别是什么啊？
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s*a
发帖数: 8 | 55 有很大的不同，要不然为啥P2和P3是等体积，N3要加的比P2多！
【在 C*******e 的大作中提到】
: P3和N3有什么区别啊？说起来我的P3不是放冰箱的呢，会不会是因为这个？
|
