f*****y
发帖数: 464 | 1 RNA probe.用brain tissue做试验。做northern blot背景很强，rRNA的位置crosshyb
很多（total RNA和polyA RNA都是），真正的条带相对很微弱。可是奇怪的用这个
probe做的FISH的结果很干净，信号看着一点不像backgroud. target出现在部分neuron
里，non-neuron里完全没有。
想请教试验大牛们，这FISH结果能相信吗？
如果FISH能crosshyb到rRNA上，看上去啥样？
怎样能改善northern的结果呢？polyA RNA仍然不能完全清除rRNA,所以还是有crosshyb
.
多谢。 |
o**i
发帖数: 1165 | 2 h会不会rRNA位置那个是真的 splice variant?
crosshyb
neuron
crosshyb
【在 f*****y 的大作中提到】
: RNA probe.用brain tissue做试验。做northern blot背景很强，rRNA的位置crosshyb
: 很多（total RNA和polyA RNA都是），真正的条带相对很微弱。可是奇怪的用这个
: probe做的FISH的结果很干净，信号看着一点不像backgroud. target出现在部分neuron
: 里，non-neuron里完全没有。
: 想请教试验大牛们，这FISH结果能相信吗？
: 如果FISH能crosshyb到rRNA上，看上去啥样？
: 怎样能改善northern的结果呢？polyA RNA仍然不能完全清除rRNA,所以还是有crosshyb
: .
: 多谢。
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m******5
发帖数: 1383 | |
f*****y
发帖数: 464 | 4 我暂时也不能确定。预测的mRNA大小在两条rRNA之间。可是每次这两条都同时出现，所
以就认为是crosshyb了。是不是如果拿sense probe做一下，如果这两条还出来就可以
肯定是crosshyb了？
【在 o**i 的大作中提到】
: h会不会rRNA位置那个是真的 splice variant?
:
: crosshyb
: neuron
: crosshyb
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f*****y
发帖数: 464 | 5 这次没有RNase处理过切片。以前试过，信号太弱就没再用了。
【在 m******5 的大作中提到】
: 楼主做fish的时候用RNAse处理过么？
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E****A
发帖数: 184 | 6 换位置重新做probe吧，如果用DIG的话，probe太短会导致背景很强的，因为非特异的
hyibridization |
f*****y
发帖数: 464 | 7 说的是。可是舍不得FISH的结果呀，真的很漂亮。如果一切重来，一是没那么多时间，
二是怕做不出那么漂亮的结果了。
【在 E****A 的大作中提到】
: 换位置重新做probe吧，如果用DIG的话，probe太短会导致背景很强的，因为非特异的
: hyibridization
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O******e
发帖数: 4845 | 8 如果你的FISH正负对照都做了，为什么要放弃？FISH跟Northern根本不一样啊
【在 f*****y 的大作中提到】
: 说的是。可是舍不得FISH的结果呀，真的很漂亮。如果一切重来，一是没那么多时间，
: 二是怕做不出那么漂亮的结果了。
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y******8
发帖数: 1764 | 9 rRNA could be inaccessible in ribosomes. Just as mentioned by BM, you should
be confident on your results with appropriate controls. |
c*********r
发帖数: 1312 | 10 能详述一下你的protocol和关键的试剂吗？
我有DIG labeled probe，用来做FISH的。现在也想用它来做Northern，不知是否可行
。之前发了个帖子：http://www.mitbbs.com/article_t0/Biology/31396723.html
多谢！
crosshyb
neuron
crosshyb
【在 f*****y 的大作中提到】
: RNA probe.用brain tissue做试验。做northern blot背景很强，rRNA的位置crosshyb
: 很多（total RNA和polyA RNA都是），真正的条带相对很微弱。可是奇怪的用这个
: probe做的FISH的结果很干净，信号看着一点不像backgroud. target出现在部分neuron
: 里，non-neuron里完全没有。
: 想请教试验大牛们，这FISH结果能相信吗？
: 如果FISH能crosshyb到rRNA上，看上去啥样？
: 怎样能改善northern的结果呢？polyA RNA仍然不能完全清除rRNA,所以还是有crosshyb
: .
: 多谢。
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E****A
发帖数: 184 | 11 没做过fish，你这个dig labeled probe多长？什么位置？
【在 c*********r 的大作中提到】
: 能详述一下你的protocol和关键的试剂吗？
: 我有DIG labeled probe，用来做FISH的。现在也想用它来做Northern，不知是否可行
: 。之前发了个帖子：http://www.mitbbs.com/article_t0/Biology/31396723.html
: 多谢！
:
: crosshyb
: neuron
: crosshyb
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n****n
发帖数: 434 | 12 Why polyA RNA也有rRNA的位置crosshyb? |
E****A
发帖数: 184 | 13 到目前为止还没有任何一个mRNA purification的kit能完全彻底除掉rRNA，总会有残余
【在 n****n 的大作中提到】
: Why polyA RNA也有rRNA的位置crosshyb?
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c*********r
发帖数: 1312 | 14 500-900nt，Target mRNA coding region，也有Target UTR的。
指点指点？
【在 E****A 的大作中提到】
: 没做过fish，你这个dig labeled probe多长？什么位置？
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E****A
发帖数: 184 | 15 长是够长。不过根据我个人经验，强烈不建议用utr region来做probe，尤其是5’-UTR
。我曾经在5'UTR region做过两个probe，效果都很不好，全杂到rrna上了，结果后来
在中间部分的两个exon上做了两个probe，结果就很漂亮。
【在 c*********r 的大作中提到】
: 500-900nt，Target mRNA coding region，也有Target UTR的。
: 指点指点？
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E****A
发帖数: 184 | 16 已经回复了你的帖子，请查看。
【在 c*********r 的大作中提到】
: 能详述一下你的protocol和关键的试剂吗？
: 我有DIG labeled probe，用来做FISH的。现在也想用它来做Northern，不知是否可行
: 。之前发了个帖子：http://www.mitbbs.com/article_t0/Biology/31396723.html
: 多谢！
:
: crosshyb
: neuron
: crosshyb
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E****A
发帖数: 184 | 17 还有，northern hybridization temperature呢？
【在 c*********r 的大作中提到】
: 500-900nt，Target mRNA coding region，也有Target UTR的。
: 指点指点？
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c*********r
发帖数: 1312 | 18 这个。。。FISH我用50-55°，70% formamide。你们用什么条件，什么公式计算杂交温
度啊？^_^
【在 E****A 的大作中提到】
: 还有，northern hybridization temperature呢？
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E****A
发帖数: 184 | 19 RNA probe的话，最好hybri和wash都用68度，可以最大程度减少背景和非特异杂交，我
用的是ambion的ultrasensitive hybridization buffer
【在 c*********r 的大作中提到】
: 这个。。。FISH我用50-55°，70% formamide。你们用什么条件，什么公式计算杂交温
: 度啊？^_^
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f*****y
发帖数: 464 | 20 我用的全套是Roche的：EasyHyb, block wash buffer set, anti-DIG-AP, CSPD。 用
的他们的protocol. 杂交和wash都是68度。
probe是3‘utr的。600多nt.
【在 c*********r 的大作中提到】
: 能详述一下你的protocol和关键的试剂吗？
: 我有DIG labeled probe，用来做FISH的。现在也想用它来做Northern，不知是否可行
: 。之前发了个帖子：http://www.mitbbs.com/article_t0/Biology/31396723.html
: 多谢！
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: crosshyb
: neuron
: crosshyb
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f*****y
发帖数: 464 | 21 大侠所说的FISH的负对照是sense probe吗？我只有做没加probe的对照。sense probe
对照对于FISH来说是必须的吗？我只知道对于northern似乎是。谢谢。
【在 O******e 的大作中提到】
: 如果你的FISH正负对照都做了，为什么要放弃？FISH跟Northern根本不一样啊
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O******e
发帖数: 4845 | 22 一般来说，不加probe的对照就应该够了
probe
【在 f*****y 的大作中提到】
: 大侠所说的FISH的负对照是sense probe吗？我只有做没加probe的对照。sense probe
: 对照对于FISH来说是必须的吗？我只知道对于northern似乎是。谢谢。
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