s********2
发帖数: 138 | 1 我们实验室有套ABI 3130xl 测序系统，本来以前都是把样品送出去测序。这两天，老
板心血来潮，让我研究一下，用这台仪器自己测序。我都鼓捣一周了，结果试剂盒的阳
性对照可以出结果，测序结果也不错。但是自己的样品死活就是不出东西。希望熟悉这
台仪器的兄弟姐妹能给的点建议。谢谢！ |
o********r
发帖数: 775 | |
s********2
发帖数: 138 | 3 嗯,oldmonster 批评的是，我总觉得自己现在的表达水平骤降。我用的是BigDye
teminator cycle sequencing kit进行测序。试剂盒里面自带一个质粒和引物，作为
control，产物和引物比例是200ng：3.2pmol（因为是双链质粒，所以用量大）。我用
的是纯化后的PCR产物和自己的引物，并且产物纯化后的A260/A280也是1.7-2.0。产物
和引物的比例是50ng：3.2pmol。进行cycle 标记，进行了25个循环。然后将标记后的
产物用Ethanol/EDTA 进行纯化。结果是：control出来结果很好，而自己的产物却只有
在很前面的地方有很高的几个峰，根本不是产物。所以我怀疑我的产物根本没有标记上
？不知道这样是不是还是不够详细。希望大家能够帮帮我！ |
l******n
发帖数: 520 | 4 PCR amplicon纯化后再跑一个gel看看条带是不是很弱，如果很弱，要浓缩产物。尽可
能多加些模板DNA |
v*******a
发帖数: 759 | 5 PCR产物怎么纯化的？确定已经去掉PCR体系里的引物了？ |
T**********t
发帖数: 1604 | 6 Control works means the sequencing kit is good. The only difference is your
template and primer. I would suggest the following:
1) purify your PCR product with a new kit;
2) double check your primer's sequence and quality (use it in regular PCR to
see if it can amplify your template);
3) do a serial dilution of your template and compare the results. |
i***a
发帖数: 11095 | 7 切胶纯化后的PCR产物作为模板的话，本来就很难成功
若是还不熟练的话，建议先将PCR产物先链接到现有的easy vector中扩增后
作为模板试试 |
b******m
发帖数: 11 | 8 把你的原始文件，扩展名ab1，作为附件贴上来看看。
【在 s********2 的大作中提到】
: 我们实验室有套ABI 3130xl 测序系统，本来以前都是把样品送出去测序。这两天，老
: 板心血来潮，让我研究一下，用这台仪器自己测序。我都鼓捣一周了，结果试剂盒的阳
: 性对照可以出结果，测序结果也不错。但是自己的样品死活就是不出东西。希望熟悉这
: 台仪器的兄弟姐妹能给的点建议。谢谢！
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M*****n
发帖数: 16729 | 9 how long is your PCR product?
what is your reaction volume?
My suspicion is you used too much template (very likely) or too little
template, given that all the other reagents (such as primers etc. ) are OK.
most likely you need reduce your template. |
s******y
发帖数: 28562 | 10 嗯，我也怀疑这个。如果在一开始有几个特别高的峰然后后面就没有了的话，
一般就是因为前面几个位点的PCR效率太高，把所有的引物或者其他底物都用光了
.
【在 M*****n 的大作中提到】
: how long is your PCR product?
: what is your reaction volume?
: My suspicion is you used too much template (very likely) or too little
: template, given that all the other reagents (such as primers etc. ) are OK.
: most likely you need reduce your template.
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s******y
发帖数: 28562 | 11 建议楼主先试验一些比较容易做的条件，比方说用plasmid 做底物。
然后浓度和底物量什么的必须要优化一下，最好仿照说明书里面推荐的浓度来做。 |
M*****n
发帖数: 16729 | 12 this is such a waste of time for a phd or a student.
it is supposed to be a tech's job because all the conditions are well
established.
no innovation, no research.
【在 s******y 的大作中提到】
: 建议楼主先试验一些比较容易做的条件，比方说用plasmid 做底物。
: 然后浓度和底物量什么的必须要优化一下，最好仿照说明书里面推荐的浓度来做。
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s******y
发帖数: 28562 | 13 yeah, I agree :) Plus sequencing is very cheap nowaday.
But if their lab runs more than 100 sequencing a month, then it is much
cheaper to do it themselves. Remember it is not the motivation of the
student, but the motivation of the boss. Hiahiahia
【在 M*****n 的大作中提到】
: this is such a waste of time for a phd or a student.
: it is supposed to be a tech's job because all the conditions are well
: established.
: no innovation, no research.
|
M*****n
发帖数: 16729 | 14 hehe, we run thousands of sequencing each months,but we have sent our
sequencer to others for free.
it is not worthy doing it by yourself, econimically and scientifically.
we once spent >$20K in a month for sequencing alone.
【在 s******y 的大作中提到】
: yeah, I agree :) Plus sequencing is very cheap nowaday.
: But if their lab runs more than 100 sequencing a month, then it is much
: cheaper to do it themselves. Remember it is not the motivation of the
: student, but the motivation of the boss. Hiahiahia
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s********2
发帖数: 138 | 15 纯化后，我也跑胶了，条带很单一。所以我一直觉得纯化没有问题，并且产物也很亮。
【在 l******n 的大作中提到】
: PCR amplicon纯化后再跑一个gel看看条带是不是很弱，如果很弱，要浓缩产物。尽可
: 能多加些模板DNA
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s********2
发帖数: 138 | 16 谢谢ThisjobIwant战友！应该不是引物的问题，因为引物做正常PCR没有问题的。我也
尝试着换不同浓度的DNA做模板了，还是不行。估计真是纯化步骤出问题了。我用的是
DNA纯化试剂盒，而不是PCR产物纯化试剂盒。可能没有把多余的引物还有dNTP的去掉。
所以我现在正在等待新的试剂盒。等做出来，再上来向大家回报。
your
to
【在 T**********t 的大作中提到】
: Control works means the sequencing kit is good. The only difference is your
: template and primer. I would suggest the following:
: 1) purify your PCR product with a new kit;
: 2) double check your primer's sequence and quality (use it in regular PCR to
: see if it can amplify your template);
: 3) do a serial dilution of your template and compare the results.
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s********2
发帖数: 138 | 17 关键是我们老板的资金并不充足。在一周之类，稍微订的东西多了些，老板就要说，资
金紧张了。所以这也是给老板省钱的方式之一。不过这也算是掌握了一门技能，如果以
后找technican的工作，也有竞争力吧？（自嘲之语）
【在 M*****n 的大作中提到】
: hehe, we run thousands of sequencing each months,but we have sent our
: sequencer to others for free.
: it is not worthy doing it by yourself, econimically and scientifically.
: we once spent >$20K in a month for sequencing alone.
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M*****n
发帖数: 16729 | 18 are you a phD? very few (almost nobody) will hire a phD to do "previous
generation" sequencing. if you are interested in sequencing, you had better
learn more about "next generation" sequencing, because that's getting hotter
and hotter.
【在 s********2 的大作中提到】
: 关键是我们老板的资金并不充足。在一周之类，稍微订的东西多了些，老板就要说，资
: 金紧张了。所以这也是给老板省钱的方式之一。不过这也算是掌握了一门技能，如果以
: 后找technican的工作，也有竞争力吧？（自嘲之语）
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s********2
发帖数: 138 | 19 嗯，是phD。不过我不拿美国的学位，我只拿国内的学位。我只是作为交流学生来美国
待两年。我不是全职做测序，呵呵。我接触过next generation sequencing。并且我还
做过一部分这方面的工作。主要是我现在的工作是需要知道基因的一些序列。如果送给
公司测得话，必须凑够一板（96个）才可以，即使不够一板，也要charge一板的钱，所
以老板就不愿意浪费了。让我自己鼓捣着测测。从自己测得control来看，仪器，药品
都应该没有问题。就是要看自己的样品的了。一定得争气，希望能够测出来，呵呵。
better
hotter
【在 M*****n 的大作中提到】
: are you a phD? very few (almost nobody) will hire a phD to do "previous
: generation" sequencing. if you are interested in sequencing, you had better
: learn more about "next generation" sequencing, because that's getting hotter
: and hotter.
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s********2
发帖数: 138 | 20 这个就是我得到的两个结果。sample就是自己的样品，另外一个是control。希望大家
能够帮帮我！谢谢了。
质粒和引物，作为control，产物和引物比例是200ng：3.2pmol（因为是双链质粒，所
以用量大）。我用的是纯化后的PCR产物和自己的引物，并且产物纯化后的A260/A280也
是1.7-2.0。产物
产物纯化试剂盒，利用了专门用于测序的那种纯化试剂盒。第二，我尝试着用了DNA浓
度梯度。但是出来的结果都是一样的。只是在最前面有几个峰。我真是不知道到底是哪
里出问题了。希望大家能够帮我分析一下。
【在 s********2 的大作中提到】
: 嗯，是phD。不过我不拿美国的学位，我只拿国内的学位。我只是作为交流学生来美国
: 待两年。我不是全职做测序，呵呵。我接触过next generation sequencing。并且我还
: 做过一部分这方面的工作。主要是我现在的工作是需要知道基因的一些序列。如果送给
: 公司测得话，必须凑够一板（96个）才可以，即使不够一板，也要charge一板的钱，所
: 以老板就不愿意浪费了。让我自己鼓捣着测测。从自己测得control来看，仪器，药品
: 都应该没有问题。就是要看自己的样品的了。一定得争气，希望能够测出来，呵呵。
:
: better
: hotter
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b****r
发帖数: 17995 | 21 PCR产物里面有其他混杂污染或者引物残留，只要不是太多，根本不是问题，不要被他
们误导
我无数次直接用不纯化的PCR产物，加点引物去测序，只要band本身亮，》95%会出来，
最多是结果不太好看，有一些杂峰。你这个是根本没有信号
我看你这个可能是引物和产物不match。从另一头设计个反向引物做普通pcr看看能不能
扩出片段，还有再设计几条测序引物
另外我不觉得自己测序有什么了不起，这个东西劳动量根本不大，比起很多分子生物的
东西好多了。自己测序，对进度控制更好，而且如果测序量大，确实会省很多钱 |
s******y
发帖数: 28562 | 22 这个很明显是你的底物浓度或者引物浓度用错了！
你这个在前面有几个巨大的峰，后面就没有峰了，说明你的PCR的前面几个反应把所有的
labeled nucleotide都用光了。
你必须回去严格检查一下你用的东西到底是什么浓度。比方说你会不会把没有稀释的引物
当成diluted working solution用了？
你应该把你的底物和引物的浓度稀释10~100倍再试一次。
另外，我建议你先用plasmid来试验一次，先不要急着用PCR product
【在 s********2 的大作中提到】
: 这个就是我得到的两个结果。sample就是自己的样品，另外一个是control。希望大家
: 能够帮帮我！谢谢了。
:
: 质粒和引物，作为control，产物和引物比例是200ng：3.2pmol（因为是双链质粒，所
: 以用量大）。我用的是纯化后的PCR产物和自己的引物，并且产物纯化后的A260/A280也
: 是1.7-2.0。产物
: 产物纯化试剂盒，利用了专门用于测序的那种纯化试剂盒。第二，我尝试着用了DNA浓
: 度梯度。但是出来的结果都是一样的。只是在最前面有几个峰。我真是不知道到底是哪
: 里出问题了。希望大家能够帮我分析一下。
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s********2
发帖数: 138 | 23 嗯，对，可能是这个问题。但是PCR产物的浓度应该不是问题，我都用分光光度计检测
过，并且用电泳法也估测了。那可能就是引物的问题了。我问一个比较弱智的问题，p
mol应该是10-12 mol吧？
有的
引物
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个很明显是你的底物浓度或者引物浓度用错了！
: 你这个在前面有几个巨大的峰，后面就没有峰了，说明你的PCR的前面几个反应把所有的
: labeled nucleotide都用光了。
: 你必须回去严格检查一下你用的东西到底是什么浓度。比方说你会不会把没有稀释的引物
: 当成diluted working solution用了？
: 你应该把你的底物和引物的浓度稀释10~100倍再试一次。
: 另外，我建议你先用plasmid来试验一次，先不要急着用PCR product
|
M*****n
发帖数: 16729 | 24 yes pmol =1E-12 mol
p
【在 s********2 的大作中提到】
: 嗯，对，可能是这个问题。但是PCR产物的浓度应该不是问题，我都用分光光度计检测
: 过，并且用电泳法也估测了。那可能就是引物的问题了。我问一个比较弱智的问题，p
: mol应该是10-12 mol吧？
:
: 有的
: 引物
|
s******y
发帖数: 28562 | 25 你把引物10~100倍稀释后再试吧
p
【在 s********2 的大作中提到】
: 嗯，对，可能是这个问题。但是PCR产物的浓度应该不是问题，我都用分光光度计检测
: 过，并且用电泳法也估测了。那可能就是引物的问题了。我问一个比较弱智的问题，p
: mol应该是10-12 mol吧？
:
: 有的
: 引物
|
s******g
发帖数: 493 | 26 看了楼主的帖子，觉得最好的方法就是先把产物连到质粒上，然后测序，这样比较容易
摸清反应条件。然后你再做直接测序也不迟。
我们实验室也做过产物直接测序，用Qiagen切胶盒子，效果很好，条件我们用的是10ul
体系：30ng模板+0.5ul 3.2uM引物，希望可以帮到你。 |
s********2
发帖数: 138 | 27 我已经严格检查了底物和产物的浓度，都是严格按照说明书来的，结果还是那个样子。
真是愁死我了。欲哭无泪呀。
有的
引物
【在 s******y 的大作中提到】
: 这个很明显是你的底物浓度或者引物浓度用错了！
: 你这个在前面有几个巨大的峰，后面就没有峰了，说明你的PCR的前面几个反应把所有的
: labeled nucleotide都用光了。
: 你必须回去严格检查一下你用的东西到底是什么浓度。比方说你会不会把没有稀释的引物
: 当成diluted working solution用了？
: 你应该把你的底物和引物的浓度稀释10~100倍再试一次。
: 另外，我建议你先用plasmid来试验一次，先不要急着用PCR product
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s********2
发帖数: 138 | 28 嗯，我已经试了质粒了，结果也还是不行啊。我想问问，你用的是3.2uM的引物么？ABI
上建议用3.2pmol呢？
10ul
【在 s******g 的大作中提到】
: 看了楼主的帖子，觉得最好的方法就是先把产物连到质粒上，然后测序，这样比较容易
: 摸清反应条件。然后你再做直接测序也不迟。
: 我们实验室也做过产物直接测序，用Qiagen切胶盒子，效果很好，条件我们用的是10ul
: 体系：30ng模板+0.5ul 3.2uM引物，希望可以帮到你。
|
s********2
发帖数: 138 | 29 谢谢大家的帮助，我已经做出来了。哈哈。尤其感谢bwmcar，还有seagoing战友。在他
们的一再提示下，我终于明白了，我的引物浓度用的不对。告诉大家，我犯得低级错误
：我把pmol当成了pM？！我当时的脑子肯定被门挤了。所以我把我的引物稀释了106倍
以后再拿来当测序引物来用的！！！所以大家就拍死我吧。真心感谢大家给我提的建议
，才能引导我想到自己犯的低级错误。向大家鞠躬了。我是新手，也没有包子发给大家
。望大家见谅。 |
b****r
发帖数: 17995 | 30 还是我的土法子好算吧
你有40多伪币，不要小气，起码发大叔我两个包子吧
【在 s********2 的大作中提到】
: 谢谢大家的帮助，我已经做出来了。哈哈。尤其感谢bwmcar，还有seagoing战友。在他
: 们的一再提示下，我终于明白了，我的引物浓度用的不对。告诉大家，我犯得低级错误
: ：我把pmol当成了pM？！我当时的脑子肯定被门挤了。所以我把我的引物稀释了106倍
: 以后再拿来当测序引物来用的！！！所以大家就拍死我吧。真心感谢大家给我提的建议
: ，才能引导我想到自己犯的低级错误。向大家鞠躬了。我是新手，也没有包子发给大家
: 。望大家见谅。
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s******y
发帖数: 28562 | 31 晕倒。这么低级的错误啊。
哈哈哈哈哈
【在 s********2 的大作中提到】
: 谢谢大家的帮助，我已经做出来了。哈哈。尤其感谢bwmcar，还有seagoing战友。在他
: 们的一再提示下，我终于明白了，我的引物浓度用的不对。告诉大家，我犯得低级错误
: ：我把pmol当成了pM？！我当时的脑子肯定被门挤了。所以我把我的引物稀释了106倍
: 以后再拿来当测序引物来用的！！！所以大家就拍死我吧。真心感谢大家给我提的建议
: ，才能引导我想到自己犯的低级错误。向大家鞠躬了。我是新手，也没有包子发给大家
: 。望大家见谅。
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s********2
发帖数: 138 | 32 哈哈，是呀，这么低级的错误，搞的我郁闷了两个周了。bmwcar战友，我真是不知道怎
么发包子呢。你教我，我有多少包子，就发给你一半，剩下的一般给seagoing战友。 |
b****r
发帖数: 17995 | 33 你到家页你那个人像右边金融中心里，个人银行业务，转账给bmwcar 20伪币就可以了
，10块算一个包子
【在 s********2 的大作中提到】
: 哈哈，是呀，这么低级的错误，搞的我郁闷了两个周了。bmwcar战友，我真是不知道怎
: 么发包子呢。你教我，我有多少包子，就发给你一半，剩下的一般给seagoing战友。
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M*****n
发帖数: 16729 | 34 congrats
你可以到我们这儿的sequencing core来当个工作了。 |
k*******s
发帖数: 214 | 35 这是sequencing PCR reaction根本没有开始，有几个可能
1. 你的引物的Tm太低，在同样退火温度下，引物没有结合好。
2. 模板的溶度太低。
3. 模板样品里面有抑制PCR反应的物质，比如EDTA
另外BigDye很稳定，自带的对照肯定能做出来，因为样品最纯的，引物M13也是最常用
的，本身做这个对照没有意义。
质粒和引物，作为control，产物和引物比例是200ng：3.2pmol（因为是双链质粒，所
以用量大）。我用的是纯化后的PCR产物和自己的引物，并且产物纯化后的A260/A280也
是1.7-2.0。产物
产物纯化试剂盒，利用了专门用于测序的那种纯化试剂盒。第二，我尝试着用了DNA浓
度梯度。但是出来的结果都是一样的。只是在最前面有几个峰。我真是不知道到底是哪
里出问题了。希望大家能够帮我分析一下。注： 后面有结果图片。
【在 s********2 的大作中提到】
: 哈哈，是呀，这么低级的错误，搞的我郁闷了两个周了。bmwcar战友，我真是不知道怎
: 么发包子呢。你教我，我有多少包子，就发给你一半，剩下的一般给seagoing战友。
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