K**********e
发帖数: 188 | 1 1 用agrose resin做IP，吸的时候即使把枪头剪掉了，还是吸不准怎么办？这样不通样
品之间加的量就有点不同了啊。
2 洗涤resin的时候，吸到最后经常会带起来一点resin，洗几次岂不是损失了一些样品
3 最后加loading buffer的时候，总是会有些残余的液体，不同组间残余的量不一样，
这样最后打算把IP产物如果一半做
wb，一半做银染，岂不是分不准了。
4 以前我提蛋白从来不加蛋白酶抑制剂！因为老师说“会降解的蛋白加了也会降解，不
会降解的自然不需要加”。现在开始加
PMSF，100mM溶解于异丙醇，按500X加。异丙醇加进去会不会对蛋白不好啊？ |
f********n
发帖数: 6465 | |
m******5
发帖数: 1383 | 3 1 resin 稀释后加，直接吸柱床密度都不一样当然不准
【在 K**********e 的大作中提到】
: 1 用agrose resin做IP，吸的时候即使把枪头剪掉了，还是吸不准怎么办？这样不通样
: 品之间加的量就有点不同了啊。
: 2 洗涤resin的时候，吸到最后经常会带起来一点resin，洗几次岂不是损失了一些样品
: 3 最后加loading buffer的时候，总是会有些残余的液体，不同组间残余的量不一样，
: 这样最后打算把IP产物如果一半做
: wb，一半做银染，岂不是分不准了。
: 4 以前我提蛋白从来不加蛋白酶抑制剂！因为老师说“会降解的蛋白加了也会降解，不
: 会降解的自然不需要加”。现在开始加
: PMSF，100mM溶解于异丙醇，按500X加。异丙醇加进去会不会对蛋白不好啊？
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m******5
发帖数: 1383 | 4 3，残液再离一次吸就干静了。。其次，你都不是用一种方法染，分得准不准和你的结
果没关系
4 加蛋白酶抑制剂混合物，个人不爱加pmsf 以前纯化时觉得对蛋白有毒性
【在 K**********e 的大作中提到】
: 1 用agrose resin做IP，吸的时候即使把枪头剪掉了，还是吸不准怎么办？这样不通样
: 品之间加的量就有点不同了啊。
: 2 洗涤resin的时候，吸到最后经常会带起来一点resin，洗几次岂不是损失了一些样品
: 3 最后加loading buffer的时候，总是会有些残余的液体，不同组间残余的量不一样，
: 这样最后打算把IP产物如果一半做
: wb，一半做银染，岂不是分不准了。
: 4 以前我提蛋白从来不加蛋白酶抑制剂！因为老师说“会降解的蛋白加了也会降解，不
: 会降解的自然不需要加”。现在开始加
: PMSF，100mM溶解于异丙醇，按500X加。异丙醇加进去会不会对蛋白不好啊？
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s******y
发帖数: 28562 | 5
这个的确是不太准。所以我们实验室就很讨厌用这个来做定量试验，但是，一般来讲，
多放一些agarose, 达到agarose 过量的程度，这样多一些少一些就比较无所谓了。
要用特别处理过的枪头，那种low protein binding 的。
这个只能多做几次重复试验，最后取平均值
这么低的浓度不会有问题。醇类在细胞内部是天然存在的代谢产物
【在 K**********e 的大作中提到】
: 1 用agrose resin做IP，吸的时候即使把枪头剪掉了，还是吸不准怎么办？这样不通样
: 品之间加的量就有点不同了啊。
: 2 洗涤resin的时候，吸到最后经常会带起来一点resin，洗几次岂不是损失了一些样品
: 3 最后加loading buffer的时候，总是会有些残余的液体，不同组间残余的量不一样，
: 这样最后打算把IP产物如果一半做
: wb，一半做银染，岂不是分不准了。
: 4 以前我提蛋白从来不加蛋白酶抑制剂！因为老师说“会降解的蛋白加了也会降解，不
: 会降解的自然不需要加”。现在开始加
: PMSF，100mM溶解于异丙醇，按500X加。异丙醇加进去会不会对蛋白不好啊？
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K**********e
发帖数: 188 | |
j*****a
发帖数: 658 | 7 要用特别处理过的枪头，那种low protein binding 的。 |
c*********r
发帖数: 1312 | 8 1. 用Wide Orifice Pipet Tips
2，3. 推荐这个kit：http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=01010345
在column里做IP这样的话resin和elution是分开的。
4. 我一直用Pierce的抑制剂，自己配的也用过，好像区别不大。
【在 K**********e 的大作中提到】
: 1 用agrose resin做IP，吸的时候即使把枪头剪掉了，还是吸不准怎么办？这样不通样
: 品之间加的量就有点不同了啊。
: 2 洗涤resin的时候，吸到最后经常会带起来一点resin，洗几次岂不是损失了一些样品
: 3 最后加loading buffer的时候，总是会有些残余的液体，不同组间残余的量不一样，
: 这样最后打算把IP产物如果一半做
: wb，一半做银染，岂不是分不准了。
: 4 以前我提蛋白从来不加蛋白酶抑制剂！因为老师说“会降解的蛋白加了也会降解，不
: 会降解的自然不需要加”。现在开始加
: PMSF，100mM溶解于异丙醇，按500X加。异丙醇加进去会不会对蛋白不好啊？
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e****s
发帖数: 1125 | 9 清洗Resin我一般都是用那种小的针头，用真空吸干，又快又干净。
不管怎么做IP定量的误差率应该都至少在30%左右。
【在 K**********e 的大作中提到】
: 1 用agrose resin做IP，吸的时候即使把枪头剪掉了，还是吸不准怎么办？这样不通样
: 品之间加的量就有点不同了啊。
: 2 洗涤resin的时候，吸到最后经常会带起来一点resin，洗几次岂不是损失了一些样品
: 3 最后加loading buffer的时候，总是会有些残余的液体，不同组间残余的量不一样，
: 这样最后打算把IP产物如果一半做
: wb，一半做银染，岂不是分不准了。
: 4 以前我提蛋白从来不加蛋白酶抑制剂！因为老师说“会降解的蛋白加了也会降解，不
: 会降解的自然不需要加”。现在开始加
: PMSF，100mM溶解于异丙醇，按500X加。异丙醇加进去会不会对蛋白不好啊？
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z*******a
发帖数: 175 | 10 try Dynal magnetic beads
Dynal magnetic beads saved my IP life |
