C*******e
发帖数: 4348 | 1 恩，做什么什么不work
比如三个TOPO-blunt end克隆
各挑了八个检测
只有一个连进去了
再比如今天做anti-GST的WB
sigma买的
用的E. coli lysate
结果背景怎么那么多啊
uninduced和induced cell看起来一模一样的
N多条条带
mmd
有谁用sigma的anti-GST？ |
i*****g
发帖数: 93 | 2 继续稀释GST的Ab，不过我没有用过sigma的，我用的是novagen的一抗，二抗如果用AP
的会没有那么
多background啦，WB就是要慢慢调，呵呵
【在 C*******e 的大作中提到】
: 恩，做什么什么不work
: 比如三个TOPO-blunt end克隆
: 各挑了八个检测
: 只有一个连进去了
: 再比如今天做anti-GST的WB
: sigma买的
: 用的E. coli lysate
: 结果背景怎么那么多啊
: uninduced和induced cell看起来一模一样的
: N多条条带
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g*****e
发帖数: 209 | 3 topo这个效率也偏低啊，是不是pcr产物不新鲜？
【在 C*******e 的大作中提到】
: 恩，做什么什么不work
: 比如三个TOPO-blunt end克隆
: 各挑了八个检测
: 只有一个连进去了
: 再比如今天做anti-GST的WB
: sigma买的
: 用的E. coli lysate
: 结果背景怎么那么多啊
: uninduced和induced cell看起来一模一样的
: N多条条带
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O******e
发帖数: 4845 | 4 印象中我就用过那个抗体，背景非常糟糕。
增加稀释倍数和洗膜力度吧，看能不能行
如果没记错，GE有个Goat的抗体还不错
【在 C*******e 的大作中提到】
: 恩，做什么什么不work
: 比如三个TOPO-blunt end克隆
: 各挑了八个检测
: 只有一个连进去了
: 再比如今天做anti-GST的WB
: sigma买的
: 用的E. coli lysate
: 结果背景怎么那么多啊
: uninduced和induced cell看起来一模一样的
: N多条条带
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C*******e
发帖数: 4348 | 5 你一抗用的什么比例稀释？
我按照说明用的1/2000
二抗是HRP的，用的1/10000
虽然说WB需要optimization
但是像这种his-tag，GST-tag之类的买的到的常用抗体
不是应该很straight forward才对么
要不然谁买啊
AP
【在 i*****g 的大作中提到】
: 继续稀释GST的Ab，不过我没有用过sigma的，我用的是novagen的一抗，二抗如果用AP
: 的会没有那么
: 多background啦，WB就是要慢慢调，呵呵
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C*******e
发帖数: 4348 | 6 mmd太惨了
要是买之前上来问一下就好了
GE的就是贵+寄出来慢
你用sigma的那个用什么倍数？
【在 O******e 的大作中提到】
: 印象中我就用过那个抗体，背景非常糟糕。
: 增加稀释倍数和洗膜力度吧，看能不能行
: 如果没记错，GE有个Goat的抗体还不错
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C*******e
发帖数: 4348 | 7 TOPO的那个是偏低
PCR是新鲜的
TOPO kit倒是放了有大半年了
【在 g*****e 的大作中提到】
: topo这个效率也偏低啊，是不是pcr产物不新鲜？
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O******e
发帖数: 4845 | 8 我也就用过一下子；记得2k稀释信号一塌糊涂，好像后来加到了五六千，信号就好一些了
【在 C*******e 的大作中提到】
: mmd太惨了
: 要是买之前上来问一下就好了
: GE的就是贵+寄出来慢
: 你用sigma的那个用什么倍数？
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C*******e
发帖数: 4348 | 9 天哪。我的也是一塌糊涂
怎么好像E.coli里一堆一堆的GST-tag蛋白似的
要稀释到5千6千？
我这次没有放positive control上去
因为没有料到这个抗体这么烂
现在手上没图
明天发个图上来帮我瞅瞅成不？
些了
【在 O******e 的大作中提到】
: 我也就用过一下子；记得2k稀释信号一塌糊涂，好像后来加到了五六千，信号就好一些了
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c********r
发帖数: 189 | 10 2k的稀释太浓了吧，我一般的抗体至少5k的稀释。。。 |
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c*********y
发帖数: 1952 | 11 nod.
这种情况（比较uninduced vs induced）我一般一抗都用10K-20K稀释。
我用过Abnova的单抗，还凑合。
【在 c********r 的大作中提到】
: 2k的稀释太浓了吧，我一般的抗体至少5k的稀释。。。
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c**k
发帖数: 1228 | 12 GST from Santa Cruz is very good. B-14.
【在 C*******e 的大作中提到】
: 你一抗用的什么比例稀释？
: 我按照说明用的1/2000
: 二抗是HRP的，用的1/10000
: 虽然说WB需要optimization
: 但是像这种his-tag，GST-tag之类的买的到的常用抗体
: 不是应该很straight forward才对么
: 要不然谁买啊
:
: AP
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O******e
发帖数: 4845 | 13 可以啊。
上样量也不能太大。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 天哪。我的也是一塌糊涂
: 怎么好像E.coli里一堆一堆的GST-tag蛋白似的
: 要稀释到5千6千？
: 我这次没有放positive control上去
: 因为没有料到这个抗体这么烂
: 现在手上没图
: 明天发个图上来帮我瞅瞅成不？
:
: 些了
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k******0
发帖数: 1073 | 14 做个small scale GST纯化，不是更可靠 ，而且比WB来得快。
【在 C*******e 的大作中提到】
: 恩，做什么什么不work
: 比如三个TOPO-blunt end克隆
: 各挑了八个检测
: 只有一个连进去了
: 再比如今天做anti-GST的WB
: sigma买的
: 用的E. coli lysate
: 结果背景怎么那么多啊
: uninduced和induced cell看起来一模一样的
: N多条条带
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C*******e
发帖数: 4348 | 15 有些别的原因所以做WB
不是为了检测GST蛋白有没有表达
只是结果出来以后更莫名其妙了
【在 k******0 的大作中提到】
: 做个small scale GST纯化，不是更可靠 ，而且比WB来得快。
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