g***x
发帖数: 645 | 1 要看二聚体,做个low temperature 的western, 用的SDS PAGE, 不用任何reducing
agent, 为了避免二聚体打开,样品不煮,整个过程４C
3,4 是正常对照, 煮沸的, 加reduce agent看到清晰的单体, 没有二聚体.
1,2 是 低温下做的, 看到二聚体,也看到 一部分单体,
现在的问题是, 二聚体的带不集中,弥散开很多,
考虑原因,
可能是因为 没有reduce, 但SDS 会起到一定打开三维结构的作用,所以,dimer 虽然是
同样的分子量, 但是形状应为蛋白去折叠的程度不同而不同, 导致泳动速度不均一, 如
果是这个原因, 不知道可以用什么方法解决 多加 SDS 不知道可以可以?
还有可能是因为ＳＤＳ插入的多少不均一,造成泳动速度不均一?
麻烦大家讨论讨论,高手指点指点 | g*********5
发帖数: 2533 | 2 it is normal.
and RT should be ok? | g***x
发帖数: 645 | 3 弥散得有点太厉害了 文献里头的都不这样,
这样的图发不了啊,
room temperature 很可能不ok,dimer 会被打开, 不过4C会是造成弥散的原因么?
【在 g*********5 的大作中提到】
: it is normal.
: and RT should be ok?
| C*******e
发帖数: 4348 | 4 可以跑个native page
就是running buffer还有sample buffer里面都没有SDS的
制备胶的时候也没有SDS
不知道你的二聚体有多大
另外是不是上样太多了
不过带弥散开来的话跑native page挺常见的
不过你不跑自己的样品也不知道对吧
【在 g***x 的大作中提到】
: 要看二聚体,做个low temperature 的western, 用的SDS PAGE, 不用任何reducing
: agent, 为了避免二聚体打开,样品不煮,整个过程４C
: 3,4 是正常对照, 煮沸的, 加reduce agent看到清晰的单体, 没有二聚体.
: 1,2 是 低温下做的, 看到二聚体,也看到 一部分单体,
: 现在的问题是, 二聚体的带不集中,弥散开很多,
: 考虑原因,
: 可能是因为 没有reduce, 但SDS 会起到一定打开三维结构的作用,所以,dimer 虽然是
: 同样的分子量, 但是形状应为蛋白去折叠的程度不同而不同, 导致泳动速度不均一, 如
: 果是这个原因, 不知道可以用什么方法解决 多加 SDS 不知道可以可以?
: 还有可能是因为ＳＤＳ插入的多少不均一,造成泳动速度不均一?
| b******i
发帖数: 287 | 5 我很小白，只是好奇：
为什么Lane 1没有Actin的带？
Load少一点样品，会不会没有这么弥散呢？那团dimer很浓啊。。。。
你做的LT的是根据文献做的？Reducing Agent你指的是什么啊？beta-ME or DTT? 这些
不是通常只是打断二硫键的么（如果我错了别笑～～）？你的Dimer是由二硫键所形成
的么？我曾经跑过一个Non-reducing的Gel，不加bete-ME or DTT，同样用高温处理过
，也可以跑出很好看的带型啊。 | g***x
发帖数: 645 | 6 我的二聚体是280KD， 特别大，但是分离没啥问题
上样量大概在35ug 左右， 不算少，我可以再少上点儿
en, 准备试试native page，不过我觉得跑native gel 更容易弥散，但你说的对，不试
试总是没法知道，试了不行至少排除了一个方法，也就算了
多谢
【在 C*******e 的大作中提到】
: 可以跑个native page
: 就是running buffer还有sample buffer里面都没有SDS的
: 制备胶的时候也没有SDS
: 不知道你的二聚体有多大
: 另外是不是上样太多了
: 不过带弥散开来的话跑native page挺常见的
: 不过你不跑自己的样品也不知道对吧
| g***x
发帖数: 645 | 7 那个lane1 develop 的时候ecl没有覆盖上，后来又重新develop了一次就没问题。应该
和这个没关系
我做的LT 是根据文献做的，reducing agent 就是指beta－ME，DTT 这些，你说的对，
是打开氧化的键，主要包括二硫键的，我的dimer 不是二硫键，是范德华力。
你说的你的例子是不用reducing agent， 但是用煮的，这样也会破坏dimer 之间的键
，起到的也是尽量reduce 蛋白的作用吧，你说的也可以跑出好看的带型，是指二硫键
没有被破坏，dimer 也没有破坏么？
【在 b******i 的大作中提到】
: 我很小白，只是好奇：
: 为什么Lane 1没有Actin的带？
: Load少一点样品，会不会没有这么弥散呢？那团dimer很浓啊。。。。
: 你做的LT的是根据文献做的？Reducing Agent你指的是什么啊？beta-ME or DTT? 这些
: 不是通常只是打断二硫键的么（如果我错了别笑～～）？你的Dimer是由二硫键所形成
: 的么？我曾经跑过一个Non-reducing的Gel，不加bete-ME or DTT，同样用高温处理过
: ，也可以跑出很好看的带型啊。
| l***y
发帖数: 4671 | 8 不加 SDS 的话，电泳主要靠蛋白质自己的电荷量，还要保证负电荷为主，需要 pH 高
于所关心的蛋白质的等电点。带的位置和蛋白质大小也没有严格的关系，要靠
antibody 来标记。同时因为电荷量不够，蛋白质会 aggregate，所以对 detergent 的
浓度很敏感。
SDS 主要靠长烷基链的憎水性来和憎水的蛋白链结合，所以会 denature 掉蛋白质，破
坏靠范德华力维持的 protein association。可以考虑用一系列浓度不同的低浓度 SDS
处理 sample 跑电泳，看 dimers 带的变化，做曲线再外推。这个方法还是对
detergent 的浓度特别敏感。而且外推的曲线很不直。。。
还可以考虑一些不会显著 denature 蛋白质的引入负电荷的办法，比如说 Coomassie G
-250 据说只会在 protein 表面引入负电荷。一直想试。哪位试过，谈谈感受？
【在 g***x 的大作中提到】
: 那个lane1 develop 的时候ecl没有覆盖上，后来又重新develop了一次就没问题。应该
: 和这个没关系
: 我做的LT 是根据文献做的，reducing agent 就是指beta－ME，DTT 这些，你说的对，
: 是打开氧化的键，主要包括二硫键的，我的dimer 不是二硫键，是范德华力。
: 你说的你的例子是不用reducing agent， 但是用煮的，这样也会破坏dimer 之间的键
: ，起到的也是尽量reduce 蛋白的作用吧，你说的也可以跑出好看的带型，是指二硫键
: 没有被破坏，dimer 也没有破坏么？
| g*********5
发帖数: 2533 | 9 用invitrogen 4-12% 的bistris胶试试？ | C*******e
发帖数: 4348 | 10 lz没说做的是强酸电泳啊
普通蛋白的话跑native gel还是一样的碱性条件下跑的
不放SDS也就是看个大概
“ pH低于所有蛋白等电点”这个应该是跑的high pI蛋白吧
我跑过两种pH<7的电泳
不好使是真的
不过跟lz遇到的问题完全无关啊
SDS
G
【在 l***y 的大作中提到】
: 不加 SDS 的话，电泳主要靠蛋白质自己的电荷量，还要保证负电荷为主，需要 pH 高
: 于所关心的蛋白质的等电点。带的位置和蛋白质大小也没有严格的关系，要靠
: antibody 来标记。同时因为电荷量不够，蛋白质会 aggregate，所以对 detergent 的
: 浓度很敏感。
: SDS 主要靠长烷基链的憎水性来和憎水的蛋白链结合，所以会 denature 掉蛋白质，破
: 坏靠范德华力维持的 protein association。可以考虑用一系列浓度不同的低浓度 SDS
: 处理 sample 跑电泳，看 dimers 带的变化，做曲线再外推。这个方法还是对
: detergent 的浓度特别敏感。而且外推的曲线很不直。。。
: 还可以考虑一些不会显著 denature 蛋白质的引入负电荷的办法，比如说 Coomassie G
: -250 据说只会在 protein 表面引入负电荷。一直想试。哪位试过，谈谈感受？
| l***y
发帖数: 4671 | 11 oops，写反了，是高 pH 条件下跑胶。改过来了。
最近在准备尝试这个 protocol，哪位做过的推荐一下公司？
http://stke.sciencemag.org/cgi/content/full/sigtrans;2006/345/p
【在 C*******e 的大作中提到】
: lz没说做的是强酸电泳啊
: 普通蛋白的话跑native gel还是一样的碱性条件下跑的
: 不放SDS也就是看个大概
: “ pH低于所有蛋白等电点”这个应该是跑的high pI蛋白吧
: 我跑过两种pH<7的电泳
: 不好使是真的
: 不过跟lz遇到的问题完全无关啊
:
: SDS
: G
| C*******e
发帖数: 4348 | 12 还好吧
吹得很神奇
不过用起来一般般啦
可以跑2-D就是了
invitrogen有卖
不过我一直不喜欢invitrogen，贵
不过他们把实验室的东西转化为商品倒是手脚很快
我一般就跑native page就好了
就用的bio-rad家的anykd TGX胶
不用SDS
【在 l***y 的大作中提到】
: oops，写反了，是高 pH 条件下跑胶。改过来了。
: 最近在准备尝试这个 protocol，哪位做过的推荐一下公司？
: http://stke.sciencemag.org/cgi/content/full/sigtrans;2006/345/p
| g***x
发帖数: 645 | 13 我 用的是3－8％ 的 Tris Acetate，分得很好
有什么特别得原因要试 4－12％ bis－tris，MOP buffer 或是 MES buffer 都是SDS
buffer？
请大鸟明示
【在 g*********5 的大作中提到】
: 用invitrogen 4-12% 的bistris胶试试？
| g***x
发帖数: 645 | 14 我是打算改变lysis buffer 里头的SDS量， 但running gel 里头，buffer 里头都还有
SDS，
实在不行就职能上Native 了，这令我很忧愁
SDS
G
【在 l***y 的大作中提到】
: 不加 SDS 的话，电泳主要靠蛋白质自己的电荷量，还要保证负电荷为主，需要 pH 高
: 于所关心的蛋白质的等电点。带的位置和蛋白质大小也没有严格的关系，要靠
: antibody 来标记。同时因为电荷量不够，蛋白质会 aggregate，所以对 detergent 的
: 浓度很敏感。
: SDS 主要靠长烷基链的憎水性来和憎水的蛋白链结合，所以会 denature 掉蛋白质，破
: 坏靠范德华力维持的 protein association。可以考虑用一系列浓度不同的低浓度 SDS
: 处理 sample 跑电泳，看 dimers 带的变化，做曲线再外推。这个方法还是对
: detergent 的浓度特别敏感。而且外推的曲线很不直。。。
: 还可以考虑一些不会显著 denature 蛋白质的引入负电荷的办法，比如说 Coomassie G
: -250 据说只会在 protein 表面引入负电荷。一直想试。哪位试过，谈谈感受？
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