n**********7
发帖数: 29 | 1 大家好。
我最近在用flow检测一种膜蛋白的表达。对于这种蛋白，现有的用于flow的抗体都是
recognize c－terminal的，所以只能做intracellular flow。我的基本步骤是分离细
胞后，加Fc block，fix，permeablize，0.5% BSA block buffer,然后分别染一抗和二
抗，只有single color。
现在遇到的问题是，这种蛋白在treatment之前，不仅在细胞表面有表达，也存在于
intracellular vesicles里，所以不知道permeablize之后会不会检测到的量不仅仅是
表面的表达量。具体应该怎么做才能够保证我仅仅检测到cell surface的量呢？或者除
了flow之外还有其他的方法更适合解决这个问题？
多谢了！
做这个实验有两个多月了，反复试结果都不好，真着急！！ |
h********0
发帖数: 944 | |
n**********7
发帖数: 29 | 3 因为现有的抗体都只recognize 蛋白的c－terminal，在细胞膜的intracellular部分。
【在 h********0 的大作中提到】
: 只检测膜蛋白为什么要permeablize？
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j****x
发帖数: 1704 | 4 我感觉还是上confocal看定位靠谱一点，否则确实很难说清楚。当然最好还是能搞定合
用的抗体
【在 n**********7 的大作中提到】
: 大家好。
: 我最近在用flow检测一种膜蛋白的表达。对于这种蛋白，现有的用于flow的抗体都是
: recognize c－terminal的，所以只能做intracellular flow。我的基本步骤是分离细
: 胞后，加Fc block，fix，permeablize，0.5% BSA block buffer,然后分别染一抗和二
: 抗，只有single color。
: 现在遇到的问题是，这种蛋白在treatment之前，不仅在细胞表面有表达，也存在于
: intracellular vesicles里，所以不知道permeablize之后会不会检测到的量不仅仅是
: 表面的表达量。具体应该怎么做才能够保证我仅仅检测到cell surface的量呢？或者除
: 了flow之外还有其他的方法更适合解决这个问题？
: 多谢了！
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n**********7
发帖数: 29 | 5 非常感谢！也在考虑confocal～phd读了两年，做的大部分实验都是用flow，感觉
tricky的地方太多，快被烦死了。。。
【在 j****x 的大作中提到】
: 我感觉还是上confocal看定位靠谱一点，否则确实很难说清楚。当然最好还是能搞定合
: 用的抗体
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h********0
发帖数: 944 | 6 我感觉同种抗体识别膜蛋白和细胞内蛋白在信号强度上可能会有差别，不知道流式仪能
不能足够敏感去检测得到 |
