g*******e
发帖数: 156 | 1 版上有经常做overlap extension PCR的朋友吗？
你们都用啥polymerase? 高保真的
我们用Phusion，感觉不是很好
请推荐一款比较好用的吧。谢谢！ |
H*******i
发帖数: 196 | 2 我一直用phusion做,只要左右引物第一次PCR没问题，还没遇到第二次PCR做不出来的。
。 |
c********b
发帖数: 363 | 3 如果两端需要加A，我用Fidelitaq （USB），一般就用Advantage HD DNA polymerase
（clontech）。
基本没问题。
【在 g*******e 的大作中提到】
: 版上有经常做overlap extension PCR的朋友吗？
: 你们都用啥polymerase? 高保真的
: 我们用Phusion，感觉不是很好
: 请推荐一款比较好用的吧。谢谢！
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g*******e
发帖数: 156 | 4 有试过三个片段一起延伸到一起吗？
【在 H*******i 的大作中提到】
: 我一直用phusion做,只要左右引物第一次PCR没问题，还没遇到第二次PCR做不出来的。
: 。
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H*******i
发帖数: 196 | 5 3个连起来有那么10多次吧（不成环，成环我就试过几次成功一次。），只有一次有一
组在第一次PCR单独片段的时候就不怎么正常的做不出来，然后分成两步连的（那次是
帮别人做的）
最多做过5片段连接
我自己做的时候overlap部分用premier计算保证退货温度68+，除了个别末端有重复序
列的比较麻烦，其他没出过什么问题 |
h***l
发帖数: 168 | 6 NEB 有个比phusion 更新的，叫Q5. 可以要一点sample。。。 |
g*******e
发帖数: 156 | 7 谢谢
你是两个两个的先overlap还是一股脑放到一起overlap?
【在 H*******i 的大作中提到】
: 3个连起来有那么10多次吧（不成环，成环我就试过几次成功一次。），只有一次有一
: 组在第一次PCR单独片段的时候就不怎么正常的做不出来，然后分成两步连的（那次是
: 帮别人做的）
: 最多做过5片段连接
: 我自己做的时候overlap部分用premier计算保证退货温度68+，除了个别末端有重复序
: 列的比较麻烦，其他没出过什么问题
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H*******i
发帖数: 196 | 8 上面写了啊，只有一次是全放一起（A-Fprimer +A+B+C+C-Rprimer）死活做不出来，最
后两两连起来的，那次有一个片段开始PCR就不太正常。
其他我自己设计的流程都是多片段放一起一次PCR成功的
条件都是
primer F+R 0.5ul 10mM each
A,B,C 各0.5ul 第一次PCR 纯化后的
dntp 200 μM each
5*HFbuffer 10ul
5%DMSO
60度退火（设计的是68度以上） |
g*******e
发帖数: 156 | |
p********i
发帖数: 116 | 10 pfu turbo
【在 g*******e 的大作中提到】
: 版上有经常做overlap extension PCR的朋友吗？
: 你们都用啥polymerase? 高保真的
: 我们用Phusion，感觉不是很好
: 请推荐一款比较好用的吧。谢谢！
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l**********1
发帖数: 5204 | 11 Mark!
【在 H*******i 的大作中提到】
: 上面写了啊，只有一次是全放一起（A-Fprimer +A+B+C+C-Rprimer）死活做不出来，最
: 后两两连起来的，那次有一个片段开始PCR就不太正常。
: 其他我自己设计的流程都是多片段放一起一次PCR成功的
: 条件都是
: primer F+R 0.5ul 10mM each
: A,B,C 各0.5ul 第一次PCR 纯化后的
: dntp 200 μM each
: 5*HFbuffer 10ul
: 5%DMSO
: 60度退火（设计的是68度以上）
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g*******e
发帖数: 156 | 12 请问你的overlap的各片段一般都是多大？
貌似小片段比较容易overlap
上了大片段就比较困难了
我们现在是1kb-2kb-1kb
【在 H*******i 的大作中提到】
: 3个连起来有那么10多次吧（不成环，成环我就试过几次成功一次。），只有一次有一
: 组在第一次PCR单独片段的时候就不怎么正常的做不出来，然后分成两步连的（那次是
: 帮别人做的）
: 最多做过5片段连接
: 我自己做的时候overlap部分用premier计算保证退货温度68+，除了个别末端有重复序
: 列的比较麻烦，其他没出过什么问题
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n***w
发帖数: 2405 | 13 我以前做4个片段overlap, a, b, c, d,
a的d的量正常加，但是b和c是加倍加，然后用phusion，work。 |
H*******i
发帖数: 196 | 14 我映像里没弄过几个都比较大的，一般就是promoter+cds+tag或者+几个spacer（最大
一般1K左右）
最终产物一般都是2K-3K左右 |
g*********5
发帖数: 2533 | 15 co mark
【在 l**********1 的大作中提到】
: Mark!
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m**m
发帖数: 349 | |
