b*****n
发帖数: 1841 | 1 一个knock in 的老鼠，目的基因与GFP融合表达。我的目的是让GFP和其它抗体共染色。
发现如下：
Harvest tissue，fix with 4% PFA overnight at 4 degree，切片后GFP无需染色可见
微弱信号，但是其它的抗体无法染色
如果直接用OCT在干冰上速冻，切片后再用4% PFA固定，其它抗体染色没有问题，GFP的
直接信号不可见，GFP抗体染色后一片smear，但是与control无GFP的tissue相比可明显
看到smear的GFP信号。
如果fix with 4% PFA for 2 hours at RT，然后incubate with 30% sucrose
overnight，那么GFP和其它抗体的染色都没有问题。
虽然我根据别人的protocol找到了解决的办法，但是一直想不清楚为什么。
为什么4% PFA固定过夜其它抗体就不能染色？为什么速冻后再用4% PFA固定，GFP信号
减弱或者变得smear？为什么固定两小时再用sucrose处理，则GFP和其它抗体的染色都
得到恢复？
大牛出来解答一下原理。 |
C**S
发帖数: 522 | 2 说明对你的抗体来说，过夜固定太长了，overfix了，2小时刚刚好。 |
z****u
发帖数: 1007 | 3 O/N PFA 固定应该没事啊
我的protocol一般都是这样的。
你有没有做antigen retrival啊。 然后一起染GFP和别的Ab. GFP antibod很好的，很
特异。 |
b*****n
发帖数: 1841 | 4 为什么先包埋再fix，GFP的信号会smear呢？如果包埋后再延长fix的时间，有没有可能
不smear？
【在 C**S 的大作中提到】
: 说明对你的抗体来说，过夜固定太长了，overfix了，2小时刚刚好。
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b*****n
发帖数: 1841 | 5 没有做retrieval。fix过度后抗原不暴露或者交联过度，然后retieval以后就可以了？
【在 z****u 的大作中提到】
: O/N PFA 固定应该没事啊
: 我的protocol一般都是这样的。
: 你有没有做antigen retrival啊。 然后一起染GFP和别的Ab. GFP antibod很好的，很
: 特异。
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z****u
发帖数: 1007 | 6 不fix的话细胞膜会裂解，GFP就漏出了。以前我做胚胎sample的时候如果没在3小时以
内固定的话，GFP都会leak out. 看起来就是一片smear.
【在 b*****n 的大作中提到】
: 为什么先包埋再fix，GFP的信号会smear呢？如果包埋后再延长fix的时间，有没有可能
: 不smear？
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b*****n
发帖数: 1841 | 7 很有用的信息。
有没有办法解救？leaky应该是发生在切片后而不是组织的冻融吧？
比如剩余的tissue在OCT溶解后取出fix？或者把冻起来的老鼠尸体软化后取组织再fix？
【在 z****u 的大作中提到】
: 不fix的话细胞膜会裂解，GFP就漏出了。以前我做胚胎sample的时候如果没在3小时以
: 内固定的话，GFP都会leak out. 看起来就是一片smear.
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z****u
发帖数: 1007 | 8 leaky 是组织细胞腐败降解了。 跟冻融没关系。单次的组织冻融不影响，比如-20度保
存很久的老鼠解冻后再固定也没啥问题。 leaky一旦发生就没法解救了，sample只有
扔掉。所以我的sample都是杀死后立马扔PFA. 一般来说GFP或者TdTomato 都不会被PFA
灭掉。 实在灭掉了那就上Ab . 很多公司都有很好的GFP antibody.很特异，很强。
组织一旦固定了就不用担心leakage 了。 |
i*****g
发帖数: 11893 | 9 这些问题不要想了，很无趣的
虽然可以给出这个或那个解释，但解释了也没有什么价值
生物实验 一堆这些细节烦恼 |
