m******t
发帖数: 109 | 1 我在２９３ 细胞里面表达一蛋白， ６HIS TAG的，用NI 方法提纯，跑胶， COOMASSIE
染色，没看见明显多的BAND，WB 是很明显增多的。 有经验的各位请指教。 PS： 准
备切胶MASS 分析。 谢先 |
e****s
发帖数: 1125 | 2 感觉就是量太少了，尽量多上样品看看。
从多少细胞里提取？表达怎么样。
COOMASSIE
【在 m******t 的大作中提到】
: 我在２９３ 细胞里面表达一蛋白， ６HIS TAG的，用NI 方法提纯，跑胶， COOMASSIE
: 染色，没看见明显多的BAND，WB 是很明显增多的。 有经验的各位请指教。 PS： 准
: 备切胶MASS 分析。 谢先
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W*******n
发帖数: 2762 | 3 HOW most of us preparing Buffers?
I use 10mM Imadizole in Lysis, 20mM in Wash, 250mM in Elution. But product
not too much. |
Z******5
发帖数: 435 | 4 可以用哺乳动物细胞系表达纯化蛋白？很少见到啊。表达量应该非常低。貌似真核的用
酵母或者果蝇表达的多一点吧？ |
c********b
发帖数: 363 | 5 this buffer cannot be autoclaved. You can only use filter to sterilize it.
【在 W*******n 的大作中提到】
: HOW most of us preparing Buffers?
: I use 10mM Imadizole in Lysis, 20mM in Wash, 250mM in Elution. But product
: not too much.
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l*******u
发帖数: 79 | 6 你是transient transfection 还是stable cell line ？很多蛋白表达量低的我都会收
一个月media 一起纯化，产量才能够用
COOMASSIE
【在 m******t 的大作中提到】
: 我在２９３ 细胞里面表达一蛋白， ６HIS TAG的，用NI 方法提纯，跑胶， COOMASSIE
: 染色，没看见明显多的BAND，WB 是很明显增多的。 有经验的各位请指教。 PS： 准
: 备切胶MASS 分析。 谢先
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s******y
发帖数: 28562 | 7 Mammalian cell 里面很多蛋白本身就有 4xHis, 会被Ni-NTA resin 一起
纯化拉下来。所以你的蛋白不能在如此多的背景蛋白中被看到。
如果你真的要用这个方法纯化蛋白的话，我的建议是：
1。用大量Hela 细胞，悬浮培养。
2。用high glucose medium.
3. 在你的蛋白上再加一个tag, 进行双重纯化。如果实在不能再加一个tag的话，也必
须至少在NTA-NI resin之后进一步用ion-exchange column + size exclusion column
进行再纯化。
COOMASSIE
【在 m******t 的大作中提到】
: 我在２９３ 细胞里面表达一蛋白， ６HIS TAG的，用NI 方法提纯，跑胶， COOMASSIE
: 染色，没看见明显多的BAND，WB 是很明显增多的。 有经验的各位请指教。 PS： 准
: 备切胶MASS 分析。 谢先
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W*******n
发帖数: 2762 | 8 sunnyday, How about HEK 293 cell? I have one Protein secreted from this line
, 6-His taged, but expression low. |
i****e
发帖数: 1527 | 9 I have the same problem, though used 293-F cells.
line
【在 W*******n 的大作中提到】
: sunnyday, How about HEK 293 cell? I have one Protein secreted from this line
: , 6-His taged, but expression low.
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s******y
发帖数: 28562 | 10 我没有亲自用过HEK 293 cells suspension culture, 但是应该也是可行的
http://hek293.com/hek293_cell_culture.html
line
【在 W*******n 的大作中提到】
: sunnyday, How about HEK 293 cell? I have one Protein secreted from this line
: , 6-His taged, but expression low.
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