m*********r
发帖数: 49 | 1 问题有点长：
我想要过表达一个来源于果蝇的蛋白，最终希望得到比较大量的这种蛋白，纯化之后做
与其他蛋白相互作用的生化实验。
问题是，这个蛋白的活性需要翻译后甲基化修饰，但是真核表达效率高的Sf9-
baculovirus系统没有这种酶，现在选择用有甲基化修饰酶的S2细胞系来表达。
如今已经建立了表达这种蛋白的稳定S2细胞系，表达并用His-tag纯化了几次，得到的
杂蛋白很多目标蛋白量很少，试着优化纯化洗脱的条件也帮助不大，目前我认为表达量
太低是主要原因。如果要在his-tag之后再做第二轮纯化，我怕少得可怜的蛋白经不起
损失了。
大家有什么推荐的解决方法么？如果要换个表达系统的话，有什么比较好的替代的吗？
还有我现在这个蛋白是由metallothionine的Promoter来启动（就是被Cu2+驱动的那个)
，这个启动子效率好像本来就是低，可是这个质粒是别的实验室建立的，我就拿来直
接用了，当初嫌麻烦也就没想着要换个启动子什么的。 |
b******y
发帖数: 627 | 2 which protein(s) methylate your protein? can you co-transfect those proteins
with yours? |
m*********r
发帖数: 49 | 3
proteins
是dPRMT5修饰我要的蛋白。你是说把我要的蛋白和dPRMT5共转染到Sf9系统么？我再去
研究下这个修饰酶的作用机制，看这么干能不能实现。多谢回复。
【在 b******y 的大作中提到】
: which protein(s) methylate your protein? can you co-transfect those proteins
: with yours?
|
s******s
发帖数: 13035 | 4 没在s2里面纯化过蛋白, 不过记得用act5c啥的比较多
【在 m*********r 的大作中提到】
: 问题有点长：
: 我想要过表达一个来源于果蝇的蛋白，最终希望得到比较大量的这种蛋白，纯化之后做
: 与其他蛋白相互作用的生化实验。
: 问题是，这个蛋白的活性需要翻译后甲基化修饰，但是真核表达效率高的Sf9-
: baculovirus系统没有这种酶，现在选择用有甲基化修饰酶的S2细胞系来表达。
: 如今已经建立了表达这种蛋白的稳定S2细胞系，表达并用His-tag纯化了几次，得到的
: 杂蛋白很多目标蛋白量很少，试着优化纯化洗脱的条件也帮助不大，目前我认为表达量
: 太低是主要原因。如果要在his-tag之后再做第二轮纯化，我怕少得可怜的蛋白经不起
: 损失了。
: 大家有什么推荐的解决方法么？如果要换个表达系统的话，有什么比较好的替代的吗？
|
a****k
发帖数: 1130 | 5 我们都是用的Actin 5C promoter
https://www.addgene.org/vector-database/1654/
【在 m*********r 的大作中提到】
: 问题有点长：
: 我想要过表达一个来源于果蝇的蛋白，最终希望得到比较大量的这种蛋白，纯化之后做
: 与其他蛋白相互作用的生化实验。
: 问题是，这个蛋白的活性需要翻译后甲基化修饰，但是真核表达效率高的Sf9-
: baculovirus系统没有这种酶，现在选择用有甲基化修饰酶的S2细胞系来表达。
: 如今已经建立了表达这种蛋白的稳定S2细胞系，表达并用His-tag纯化了几次，得到的
: 杂蛋白很多目标蛋白量很少，试着优化纯化洗脱的条件也帮助不大，目前我认为表达量
: 太低是主要原因。如果要在his-tag之后再做第二轮纯化，我怕少得可怜的蛋白经不起
: 损失了。
: 大家有什么推荐的解决方法么？如果要换个表达系统的话，有什么比较好的替代的吗？
|
r**a
发帖数: 121 | 6 可能确实是promoter的问题，pMT诱导GFP，很多时候直接看都看不到荧光，western可
以检测到。如果没有别的办法，用pAc5试试吧。
我一般都尽量避免用果蝇细胞表达蛋白，如果实在要，干脆用果蝇表达，用cage收集卵！
【在 m*********r 的大作中提到】
: 问题有点长：
: 我想要过表达一个来源于果蝇的蛋白，最终希望得到比较大量的这种蛋白，纯化之后做
: 与其他蛋白相互作用的生化实验。
: 问题是，这个蛋白的活性需要翻译后甲基化修饰，但是真核表达效率高的Sf9-
: baculovirus系统没有这种酶，现在选择用有甲基化修饰酶的S2细胞系来表达。
: 如今已经建立了表达这种蛋白的稳定S2细胞系，表达并用His-tag纯化了几次，得到的
: 杂蛋白很多目标蛋白量很少，试着优化纯化洗脱的条件也帮助不大，目前我认为表达量
: 太低是主要原因。如果要在his-tag之后再做第二轮纯化，我怕少得可怜的蛋白经不起
: 损失了。
: 大家有什么推荐的解决方法么？如果要换个表达系统的话，有什么比较好的替代的吗？
|
m*********r
发帖数: 49 | 7 多谢大家的帮忙，shakuras和ajwook推荐的换成actin 5c启动子的确是最直观值得一试
的解决办法。roca说直接用果蝇表达，这样的好处是目标蛋白的翻译后修饰确定性更高
。 |
s******9
发帖数: 45 | 8 可以用PUAST的载体，不过要同时转入一个表达Gal4的质粒。同样量的DNA表达出的蛋白
量比pAc和pMT高很多。 |
m*********r
发帖数: 49 | 9
找了一下这个pUAST载体，好像主体还是个Hsp70的promoter，我以前印象里这个不是
constitutive的么？还是这个比较特别，需要Gal4驱动？我对这个系统不咋懂，我再去
研究下，多谢回复！
【在 s******9 的大作中提到】
: 可以用PUAST的载体，不过要同时转入一个表达Gal4的质粒。同样量的DNA表达出的蛋白
: 量比pAc和pMT高很多。
|
s***m
发帖数: 6197 | 10 invitrogen是不是有一个S2的表达系统(secretion vector)，能把要表达的蛋白分泌到
细胞外，这样纯化就比较容易了
【在 m*********r 的大作中提到】
: 问题有点长：
: 我想要过表达一个来源于果蝇的蛋白，最终希望得到比较大量的这种蛋白，纯化之后做
: 与其他蛋白相互作用的生化实验。
: 问题是，这个蛋白的活性需要翻译后甲基化修饰，但是真核表达效率高的Sf9-
: baculovirus系统没有这种酶，现在选择用有甲基化修饰酶的S2细胞系来表达。
: 如今已经建立了表达这种蛋白的稳定S2细胞系，表达并用His-tag纯化了几次，得到的
: 杂蛋白很多目标蛋白量很少，试着优化纯化洗脱的条件也帮助不大，目前我认为表达量
: 太低是主要原因。如果要在his-tag之后再做第二轮纯化，我怕少得可怜的蛋白经不起
: 损失了。
: 大家有什么推荐的解决方法么？如果要换个表达系统的话，有什么比较好的替代的吗？
|
|
|
s******s
发帖数: 13035 | 11 这个是做genetics用的, 你还是老老实实用标准的表达载体把
【在 m*********r 的大作中提到】
:
: 找了一下这个pUAST载体，好像主体还是个Hsp70的promoter，我以前印象里这个不是
: constitutive的么？还是这个比较特别，需要Gal4驱动？我对这个系统不咋懂，我再去
: 研究下，多谢回复！
|
k*****n
发帖数: 323 | 12 hsp70只是constitutively recruit Pol II，但不延伸。需要别的activator。这个
pUAST里有uas site，response to Gal4
【在 m*********r 的大作中提到】
:
: 找了一下这个pUAST载体，好像主体还是个Hsp70的promoter，我以前印象里这个不是
: constitutive的么？还是这个比较特别，需要Gal4驱动？我对这个系统不咋懂，我再去
: 研究下，多谢回复！
|
g**v
发帖数: 345 | 13 1.S2细胞的转染效率不算高;
2. 表达载体可以用pAC5.1, 是actin5C的promoter
3. 如果用GAL4-UAS系统来表达的话，可以用pAC5.1-GAL4, and pUAST-your gene. 也
可以用armadillo-GAL4或其它在S2里表达的GAL4。
4.在果蝇里表达的话，要先构建pUAST-gene的载体，然后做转基因果蝇，不知对你可
行否
建议直接用pAC5.1里表达，或如上面提到的分泌到胞外然后纯化。
【在 m*********r 的大作中提到】
:
: 找了一下这个pUAST载体，好像主体还是个Hsp70的promoter，我以前印象里这个不是
: constitutive的么？还是这个比较特别，需要Gal4驱动？我对这个系统不咋懂，我再去
: 研究下，多谢回复！
|
b******y
发帖数: 627 | 14 LZ needs both decent expression of his/her target protein and proper
methylation by dPRMT5.
By secreting the protein out, the protein will never meet with the
methylation enzyme.
One promising way is to transfect the target protein with dPRMT5+dMEP50 into
Sf9 or other well established insect cell expression systems. I know dMEP50
is required for dPRMT5 activity but not sure whether there are other
factors specific for his/her target protein as well. For example, in
mammalian systems, methylation of Sm proteins by PRMT5 also requires pICln
besides MEP50. |
m*********r
发帖数: 49 | 15 我个人也有点倾向于转到Sf9系统试试，因为手上有还没用完的bac to bac cloning
kit。我忘了以前是在哪看到过有的baculovirus vector可以一个载体表达2个蛋白的，
好像是invitrogen的，刚想去找没找到。
into
dMEP50
【在 b******y 的大作中提到】
: LZ needs both decent expression of his/her target protein and proper
: methylation by dPRMT5.
: By secreting the protein out, the protein will never meet with the
: methylation enzyme.
: One promising way is to transfect the target protein with dPRMT5+dMEP50 into
: Sf9 or other well established insect cell expression systems. I know dMEP50
: is required for dPRMT5 activity but not sure whether there are other
: factors specific for his/her target protein as well. For example, in
: mammalian systems, methylation of Sm proteins by PRMT5 also requires pICln
: besides MEP50.
|
b******y
发帖数: 627 | 16 One vector expressing two proteins is always available called pFASTBac Dual
or something alike.
There is a vector good for many proteins in the same vector. David Barford
and coworkers expressed all 13 components of APC complex in insect cell
using two baculoviruses, MultiBac, developed by Timothy Richmond at Harvard
in 2004. |
b******y
发帖数: 627 | 17 For you, it is unnecessary to use Multibac. You can clone dPRMT5 and dMEP50
into one pFASTBac Dual and your target protein into pFASTBac. Make viruses
of both vectors and co-transfect Sf9 cell. You should be in OK shape. |
a****k
发帖数: 1130 | 18 单就难易程度讲，没觉得这使得纯化容易了。。。你想想是裂解个细胞方便，还是把那
么多那么多的medium过柱子方便。。。
【在 s***m 的大作中提到】
: invitrogen是不是有一个S2的表达系统(secretion vector)，能把要表达的蛋白分泌到
: 细胞外，这样纯化就比较容易了
|
a****k
发帖数: 1130 | 19 要我说，三个蛋白dual也用不到，直接三个不同的virus加进去就行。但问题是，能保
证只要有了dPRMT5 和 dMEP50，那个蛋白就会被methylated吗
dMEP50
【在 b******y 的大作中提到】
: For you, it is unnecessary to use Multibac. You can clone dPRMT5 and dMEP50
: into one pFASTBac Dual and your target protein into pFASTBac. Make viruses
: of both vectors and co-transfect Sf9 cell. You should be in OK shape.
|
b******y
发帖数: 627 | 20 Hetero-octameric rPRMT5/dMEP50 should be pretty active. There is plenty of
ATP and SAM in Sf9 cells. LZ will be very unlucky if this doesn't work. |
s***m
发帖数: 6197 | 21 对 的确是 还是要看最后蛋白的用途了
我们以前直接就是直接把蛋白沉淀了
不会太麻烦的
【在 a****k 的大作中提到】
: 单就难易程度讲，没觉得这使得纯化容易了。。。你想想是裂解个细胞方便，还是把那
: 么多那么多的medium过柱子方便。。。
|
m*********r
发帖数: 49 | 22 我刚想求证下甲基化底物SAM的事，就直接被你回答了。
再次多谢楼上各位的持续帮助！
【在 b******y 的大作中提到】
: Hetero-octameric rPRMT5/dMEP50 should be pretty active. There is plenty of
: ATP and SAM in Sf9 cells. LZ will be very unlucky if this doesn't work.
|
