c********n
发帖数: 225 | 1 谈谈和蛋白打交道的日子 （一）
序
笔者已经做了多年和蛋白相关的科研与服务，产品研发生产以及产业化。在这里分享一
下与蛋白打交道这些年带来的一些感想。其实所有的科学研究都是用来解决人类已经和
即将遇到的各种各样的问题的，只有解决了问题才会有更大的存在价值。
第一篇 DNA测序， Sanger Style - 纪念Frederick Sanger
2013年11月20号，Frederick Sanger 去世了， 享年95岁。Sanger是DNA测序之父，获
得过两次诺贝尔奖， 一个是1958年蛋白测序， 另一个是1980年DNA测序。虽然DNA结构
发现的比蛋白晚， 但毕竟是genetic code，master script。ATCG四个碱基的组合比蛋
白的20个氨基酸的天文数字组合可更容易研究找规律了。人天生就是个好奇的动物，
最喜欢找规律, 尤其喜欢从简单的地方入手，所以围绕DNA的研究在Watson-Crick的碱
基配对这个简单地规律被发现以后，起来的就比蛋白快了很多。其实DNA和蛋白， 就像
是帅才和将才， 他们的用处是不同的，需要出色的帅才（DNA）订好了方向，能干的将
才（蛋白）来实现这个宏伟蓝图， 中间再加上很多配合和实时的调整执行。当然这个
比喻是大大简化了复杂的生命规律。这样想想，Sanger大师就更高一筹了，把分析这些
分子水平的帅和将的方法非常简洁的给搞定了， 而简单的通常就是最好的。随后人类
基因测序也是靠着Sanger sequencing完成的， Sanger大师也就间接地把生活中的帅和
将- Bill Clinton， J Craig Venter和Francis Collins等人，通过这个人类基因组测
序推到了风口浪尖上。到现在随着技术的发展和革新，各种形式的测序可是每个做生物
实验的人必须用到的？有多少公司也是这样年复一年的养了不少人。测序这个技术推动
了生命科学的进展， 也造就了很多商业精英， 这个读一读J Craig Venter的A Life
Decoded会发现很多有趣的描述。读的时候别忘了带上自己的过滤镜， 可别被这个Jobs
级别的reality distortion的大师给忽悠的太厉害。
世界上最好的赞美是来自于曾经的对手。Sanger 和 Venter在human genome信息公开化
上面是有过不少公开的争议的， 也算是对手吧。J Craig Venter在2013年11月20日这
天 是这样在twitter上评价 Sanger的：
One of the most important scientists of the 20th century! Fred Sanger has
died. He twice changed the direction of the scientific world.
— J. Craig Venter (@JCVenter) November 20, 2013
为了纪念Sanger大师的贡献， 这里我回顾一下当年和DNA 测序有关的一些趣事。
那年我需要在大肠杆菌里面表达和纯化一个100kDa的蛋白， 然后做它的NMR结构研究。
这个可不是个小事情， 很多师兄师姐听说了都闪了。我觉得100这个数字不错， 就很
兴奋地接了下来。当然，这个蛋白也就成了一辈子总记挂着的一个事情。就像一些人和
事，平时可能不常想着， 但是到了思绪比较安静的时候，就会在不经意之间出现在你
的flash记忆里， 而且随着时间的推移，会给你不同的苦辣酸甜的感受。好啦， 回到
测序。 刚接到这个100kDa蛋白项目的时候，是从一个刚拿到tenure track position的
前辈手里继承下来的。 前辈的笔记写的非常清晰， 用了一个一共五步的cloning
procedure， 包括 mung bean nuclease treatment，好几个restriction enzyme的不
同组合， 好fancy！现在这些就交给个基因合成公司就可以解决的小case， 当时看起
来和做起来可是心潮澎湃的事情。我把前辈的笔记抱着看了一遍又一遍，restriction
enzyme就看那时的NEB catalogue。NEB的restriction enzyme是由另一个诺贝尔大师
Richard J Roberts领导做的， 他们的catalogue可是我们几个人研究restriction
enzyme的宝典，从头到尾看个一字不漏； 这样的宝典如今可是不多见了， 到现在我还
保留着一份， 真是经典。
看完了前辈的笔记， 对他是佩服的五体投地， 这么复杂精密的设计， 我可是永远也
不会想出来的。表达clone就在自己一步步精心follow前辈的笔记中拿到了。下面是测
序。当年可是要手工同位素35S 测序的，要花不少时间。自己是个急脾气的人，决定表
达和测序同时进行。可是蛋白表达没有结果！怎么会这样呢？于是就静一静心， 踏实
开始了测序。测序的胶是要自己制备的。制备胶的玻璃板子要清洗的非常干净，用酒精
再擦拭一遍， 然后涂上silicone coating。 灌胶时是不能出任何气泡的， 否则一张
大胶就报废了。 这可是好几个小时的工作， 也是个体力活。 跟在postdoc师兄后面看
了几次以后，自己第一次做是在一个夏天。早上先看了几遍实验流程， 又和师兄讨论
了一下， 把所有的原材料都准备好， 每个部件整齐归位， 就开始了。 第一张胶铺得
很顺利，心里美极了， 叫来了师兄， 想听他称赞几句。哎，师兄有火眼金睛， 一下
就看到了一个非常细小的气泡。不行， 重来。 好吧， 就到午饭时间了， 心情还不是
太坏， 还有一个下午呢， 没问题。吃完午饭， 从头再来，这次感觉像个大师。 可是
大师失手了， 这次的气泡自己都能一眼看见！没有和师兄说， 就决定再来一次。第三
次就着急了，开始就不顺利， 结果当然也不好。 晚饭时间到了，心情可是比较糟糕的
。 师兄说没事的， 明天再来吧。自己明天还有个TA要做准备（我们系每个RA研究生必
须要做两门课的免费TA）， 就先放下了这个胶的事情。
可是到了晚上别的事情都做完了， 自己很不甘心， 决定回实验室把这个胶铺好。这样
第二天就可以测序了。就又回到实验室，开始了铺胶。第一次做完有一个小气泡。已经
到凌晨了， 回家呢还是接着做？嗯， 接着做。又做了几遍不记得了，最后很成功，
一个气泡也没有！功夫不负有心人。这时看看表已经是早上5点多了。Bus没有了，就走
路回家。 直到今天都还可以感受到那个夏天清晨清凉的空气的的味道。中间要路过一
个学校养鸡场， 是做IgY抗体用的。那天黎明的鸡鸣声就好像是在给自己打气。回家睡
了不到三个小时又回到实验室，那天的Sanger DNA测序是成功的。
所有实验都是要经过不同的磨难的。DNA测序结果出来了，有一个frame shift。这就是
蛋白没有表达的原因吧？自己哪里做错了？于是又回去查笔记， 一个个碱基的对， 真
是的， 前辈设计精密的步骤里果然藏着个frame shift。怎么办呢？就去打电话问前辈
， 前辈信心满满， 绝对没有问题的， 怎么会有问题呢？好吧，咬咬牙，自己想办法
。于是， 找到另一个师兄， 请他帮看看。 这个师兄有着完全不同的做事方法， 喜欢
简单， 一下子给设计了一个非常简便的方法，找到两个restriction enzyme，先用
wild type template把clone里有frame shift的一段给PCR出来正确的，再re-clone 替
换。拿到clone以后决定还是蛋白表达和测序同时进行省时间。 这次蛋白可是表达出来
了！又做了不少DNA 测序来证明clone真的是正确的。 这一番折腾之后，感觉自己是分
子生物的熟手了， 也不盲目的崇拜前辈们了。 从此，每一个实验都要自己认真看几遍
实验流程， 不管是谁设计的。 而且，每次都想， 有没有更简单的方法呢？ 简单能做
到的，总是最好的。
现在DNA测序早已经是放到信封里等email 数据回来的年代了。Restriction enzyme也
一度不是那么风光了。可是风水总是轮流转的， 就像fashion也总是会隔几十年再回来
。现在Synthetic biology等新兴领域又把这些尘封的经典们搬出来晒太阳。前一次参
加Synthetic biology大会， 遇到了好几个非常年轻的物理系和工程系来做生物的学生
。 他们对restriction enzyme和Sanger DNA 测序表现出来的小孩子见到糖果般的好奇
与痴迷， 以及对于自己亲手做出来的这些实验的经验分享，和他们眼神里的那种兴奋
， 足以让Sanger老先生在天上也会满足的微笑了吧。
经典是永远不会过时的。
CoinbyCoin
2013 圣诞 |
f**u
发帖数: 346 | |
s******s
发帖数: 13035 | 3 亲手测过序列的都是老前辈了。我是只看到过设备和大板，
从没有自己测过。做学生的时候每次看到无数大牛的毕业论文
标题就是xxx基因的克隆和测序，顿时心向往之。。。
【在 c********n 的大作中提到】
: 谈谈和蛋白打交道的日子 （一）
: 序
: 笔者已经做了多年和蛋白相关的科研与服务，产品研发生产以及产业化。在这里分享一
: 下与蛋白打交道这些年带来的一些感想。其实所有的科学研究都是用来解决人类已经和
: 即将遇到的各种各样的问题的，只有解决了问题才会有更大的存在价值。
: 第一篇 DNA测序， Sanger Style - 纪念Frederick Sanger
: 2013年11月20号，Frederick Sanger 去世了， 享年95岁。Sanger是DNA测序之父，获
: 得过两次诺贝尔奖， 一个是1958年蛋白测序， 另一个是1980年DNA测序。虽然DNA结构
: 发现的比蛋白晚， 但毕竟是genetic code，master script。ATCG四个碱基的组合比蛋
: 白的20个氨基酸的天文数字组合可更容易研究找规律了。人天生就是个好奇的动物，
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T****u
发帖数: 424 | |
f****h
发帖数: 20 | 5 景仰前辈！现在已经很难想象没有商业化测序，没有基因合成的话实验要怎么做。 |
j*****9
发帖数: 716 | |
g*****p
发帖数: 451 | 7 能这样写东西的写手们都快死绝了
楼主一定要坚持住！
另外一个建议，把你的实验内容写详细点
这样便于大家了解实验流程，对刚入门的学生的实验设计会帮助很大的
我正好给学生们开生物史的课，很有兴趣读楼主的东西
讲课的时候也可以多掰点花边新闻
【在 c********n 的大作中提到】
: 谈谈和蛋白打交道的日子 （一）
: 序
: 笔者已经做了多年和蛋白相关的科研与服务，产品研发生产以及产业化。在这里分享一
: 下与蛋白打交道这些年带来的一些感想。其实所有的科学研究都是用来解决人类已经和
: 即将遇到的各种各样的问题的，只有解决了问题才会有更大的存在价值。
: 第一篇 DNA测序， Sanger Style - 纪念Frederick Sanger
: 2013年11月20号，Frederick Sanger 去世了， 享年95岁。Sanger是DNA测序之父，获
: 得过两次诺贝尔奖， 一个是1958年蛋白测序， 另一个是1980年DNA测序。虽然DNA结构
: 发现的比蛋白晚， 但毕竟是genetic code，master script。ATCG四个碱基的组合比蛋
: 白的20个氨基酸的天文数字组合可更容易研究找规律了。人天生就是个好奇的动物，
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m*********D
发帖数: 1727 | 8 哈哈，是啊，sequencing gel跑了多年，压那些X-光片，都是美好的回忆。
读博士的时候，在国内给Bio-rad纯化一种高温DNA polymerase，能解决sequecing反应
时不少二级结构的问题，还挣过几千外快呢。S-35是后来的吧，记得前面用p-32，后来
是P-33，再到S-35。
NEB的catalog确实是一本分子克隆的好书。在国内虽然是作分子生物学出生，克隆没少
作，但来美国作博士后，要作knockout construct时，才真正变成cloning expert：
pUC18里要塞进一个20kb的片断，找合适的restriction enzyme都困难呀。记得当时就
一个Not I是识别八个bp的酶，很有用，另一个是Sal I。Sal I是识别六个bp,但在老鼠
genome里，不知什么原因，位点很少，几个constructs的最后一步，三片断连接都是两
边用Sal I和中间另一个酶。有一个cloning strategy, 整整两天都没有想出来，只好
周末放弃了，去钓鱼，突然想出来的。那时候NEB catalog是比Molecular Cloning还重
要的书--restriction enzyme的甲基化，不同酶的中间四个bp的相容性，NEB四个
buffer和不同酶的活性，是每天都要翻阅的。
正是那两年作knock-out construccts的经历为现在这个饭碗打下了基础。tissue
culture是从ES cell培养开始的。有了作knockout conotstructs 和ES cell的经验，
进现在工作的这个实验室后，十多年基本上没有任何难倒我的bench work。开始一年老
板还不相信俺的手，一年后，无论是tissue culture还是cloning，实验室学生碰到问
题，老板都让他们找我。这两项就是我工作的保障啊。
不作cloning都快十年了，restriction enzyme也很难得用到了，偶尔学生会来问问，
还能带来一些美好的回忆。前年毕业的一个学生，在实验室作了六年也没碰过cloning
。毕业临走的时候听说我是当年的克隆高手，特地让我给她讲了一小时的课。只是那些
cloning技术现在已经没有多少用武之地了。
老了老了。女儿走出大学校门第一年就比我这个博士后老爸工资高不少。这几天女儿过
节回家，和她聊天，说她学CS赶上了好时候。2001年前后那段日子，CS毕业生难找工作
，好几个我写过推荐信进CS读master的叔叔阿姨们当时也是走投无路呢。今天他们都不
错，比我这个生物老博士后混得好多了。不过，咱也满足了，再混个五到十年，儿子进
了大学，咱完成了作父母的责任，也就不必为五斗折腰了。可以和太太在蓝天碧水间逍
遥，钓鱼种菜为生。 |
t*****w
发帖数: 254 | 9 I can see the sophisticated science here. Unfortunately, biology salary is
nowhere to compete with computer's.
【在 m*********D 的大作中提到】
: 哈哈，是啊，sequencing gel跑了多年，压那些X-光片，都是美好的回忆。
: 读博士的时候，在国内给Bio-rad纯化一种高温DNA polymerase，能解决sequecing反应
: 时不少二级结构的问题，还挣过几千外快呢。S-35是后来的吧，记得前面用p-32，后来
: 是P-33，再到S-35。
: NEB的catalog确实是一本分子克隆的好书。在国内虽然是作分子生物学出生，克隆没少
: 作，但来美国作博士后，要作knockout construct时，才真正变成cloning expert：
: pUC18里要塞进一个20kb的片断，找合适的restriction enzyme都困难呀。记得当时就
: 一个Not I是识别八个bp的酶，很有用，另一个是Sal I。Sal I是识别六个bp,但在老鼠
: genome里，不知什么原因，位点很少，几个constructs的最后一步，三片断连接都是两
: 边用Sal I和中间另一个酶。有一个cloning strategy, 整整两天都没有想出来，只好
|
o******n
发帖数: 511 | |
|
|
c**********n
发帖数: 177 | 11 I can feel the sophisticated algorithms in your mind. Unfortunately, IT
salary is nowhere to compete with a stock broker.
【在 t*****w 的大作中提到】
: I can see the sophisticated science here. Unfortunately, biology salary is
: nowhere to compete with computer's.
|
c**********n
发帖数: 177 | |
c********n
发帖数: 225 | 13 谢谢大家的支持
答复midwestPstD：
- 羡慕你的green thumb；
这个也是像学会自行车一样， 一旦领悟， 就不会丢掉了， 即使多年不骑车。
答复tankerw：
关于IT和生物的一些讨论， 很有意思。 其实IT也是经历起伏的；
生物这个行业生命力是很持久的；以后针对这个命题我也想想给一些实例出来 |
T**********2
发帖数: 38 | 14 曾经银染过测序胶的路过。
手工测序，制胶、跑胶、显影（同位素或非放）都不是问题，真正难的是读序，尤其是
读到密集的地方，有时还有band compression, G4 trap等。一个反应要读出尽可能长
的序列，往往读花了眼。 |
s******s
发帖数: 13035 | 15 以前clone的trick真是多。做phd得时候，有一个实在
找不到合适单切的载体，随口一提，老板说可以加EB切，
以前闻所未闻啊
【在 m*********D 的大作中提到】
: 哈哈，是啊，sequencing gel跑了多年，压那些X-光片，都是美好的回忆。
: 读博士的时候，在国内给Bio-rad纯化一种高温DNA polymerase，能解决sequecing反应
: 时不少二级结构的问题，还挣过几千外快呢。S-35是后来的吧，记得前面用p-32，后来
: 是P-33，再到S-35。
: NEB的catalog确实是一本分子克隆的好书。在国内虽然是作分子生物学出生，克隆没少
: 作，但来美国作博士后，要作knockout construct时，才真正变成cloning expert：
: pUC18里要塞进一个20kb的片断，找合适的restriction enzyme都困难呀。记得当时就
: 一个Not I是识别八个bp的酶，很有用，另一个是Sal I。Sal I是识别六个bp,但在老鼠
: genome里，不知什么原因，位点很少，几个constructs的最后一步，三片断连接都是两
: 边用Sal I和中间另一个酶。有一个cloning strategy, 整整两天都没有想出来，只好
|
c********n
发帖数: 225 | 16 回复 Teletubbies2
- 是的，很多步骤；
- Lloyd Smith这个学物理的来搞生物，就是因为头疼这些难处，
才想法子做的DNA sequencer |
c********n
发帖数: 225 | 17 回复 shakuras
-是的；
-看看Ham Smith； Daniel G. Gibson； J Craig Venter 他们制造synthetic
organism的方法， 用了不少经典； |
c*********r
发帖数: 1046 | 18 文笔真好，等待下文。
我也铺过测序胶，，佩服LZ！ |
B*H
发帖数: 2158 | 19 牛！
看着真象教科书级别的。只有做生物的才能有体会。 |
m**********v
发帖数: 33 | 20 这也许就是大部分千老们的归宿吧。感慨万千啊。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 哈哈，是啊，sequencing gel跑了多年，压那些X-光片，都是美好的回忆。
: 读博士的时候，在国内给Bio-rad纯化一种高温DNA polymerase，能解决sequecing反应
: 时不少二级结构的问题，还挣过几千外快呢。S-35是后来的吧，记得前面用p-32，后来
: 是P-33，再到S-35。
: NEB的catalog确实是一本分子克隆的好书。在国内虽然是作分子生物学出生，克隆没少
: 作，但来美国作博士后，要作knockout construct时，才真正变成cloning expert：
: pUC18里要塞进一个20kb的片断，找合适的restriction enzyme都困难呀。记得当时就
: 一个Not I是识别八个bp的酶，很有用，另一个是Sal I。Sal I是识别六个bp,但在老鼠
: genome里，不知什么原因，位点很少，几个constructs的最后一步，三片断连接都是两
: 边用Sal I和中间另一个酶。有一个cloning strategy, 整整两天都没有想出来，只好
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m*********D
发帖数: 1727 | 21 哈哈，还好啦。人总是要老去的。
五年前和实验室的一个Ph.D./M.D.学生合作一个课题，等上了路，学生死活不让我插手
了，怕bench上作不过我，他毕不了业。老板和我长谈了几次，最后我去开辟新战场。
五年了，小伙子利用自己在IT上面的长处，把课题从纯粹的生物推到了Bioinformatics
上，把bench上的结果和public-available的micro-array data结合起来，给实验室开
辟了一个新的方向。
【在 m**********v 的大作中提到】
: 这也许就是大部分千老们的归宿吧。感慨万千啊。
|
w***r
发帖数: 709 | 22 感动ing
【在 c********n 的大作中提到】
: 谈谈和蛋白打交道的日子 （一）
: 序
: 笔者已经做了多年和蛋白相关的科研与服务，产品研发生产以及产业化。在这里分享一
: 下与蛋白打交道这些年带来的一些感想。其实所有的科学研究都是用来解决人类已经和
: 即将遇到的各种各样的问题的，只有解决了问题才会有更大的存在价值。
: 第一篇 DNA测序， Sanger Style - 纪念Frederick Sanger
: 2013年11月20号，Frederick Sanger 去世了， 享年95岁。Sanger是DNA测序之父，获
: 得过两次诺贝尔奖， 一个是1958年蛋白测序， 另一个是1980年DNA测序。虽然DNA结构
: 发现的比蛋白晚， 但毕竟是genetic code，master script。ATCG四个碱基的组合比蛋
: 白的20个氨基酸的天文数字组合可更容易研究找规律了。人天生就是个好奇的动物，
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h********0
发帖数: 12056 | 23 精彩！
【在 c********n 的大作中提到】
: 谈谈和蛋白打交道的日子 （一）
: 序
: 笔者已经做了多年和蛋白相关的科研与服务，产品研发生产以及产业化。在这里分享一
: 下与蛋白打交道这些年带来的一些感想。其实所有的科学研究都是用来解决人类已经和
: 即将遇到的各种各样的问题的，只有解决了问题才会有更大的存在价值。
: 第一篇 DNA测序， Sanger Style - 纪念Frederick Sanger
: 2013年11月20号，Frederick Sanger 去世了， 享年95岁。Sanger是DNA测序之父，获
: 得过两次诺贝尔奖， 一个是1958年蛋白测序， 另一个是1980年DNA测序。虽然DNA结构
: 发现的比蛋白晚， 但毕竟是genetic code，master script。ATCG四个碱基的组合比蛋
: 白的20个氨基酸的天文数字组合可更容易研究找规律了。人天生就是个好奇的动物，
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c********n
发帖数: 225 | 24 回复 MidwestPstD
高风亮节。赞一个
新年快乐 |
b****r
发帖数: 17995 | |
l**********1
发帖数: 5204 | 26 Dozen Ys ago,
auto sequencer ABI Prism 3100 or 3700
15 Ys ago ABI 310 or 373 already didn't use Sanger isotope labelling..
Pls refer,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10220426
Ps:
matrix used almost above types then..
【在 m*********D 的大作中提到】
: 哈哈，是啊，sequencing gel跑了多年，压那些X-光片，都是美好的回忆。
: 读博士的时候，在国内给Bio-rad纯化一种高温DNA polymerase，能解决sequecing反应
: 时不少二级结构的问题，还挣过几千外快呢。S-35是后来的吧，记得前面用p-32，后来
: 是P-33，再到S-35。
: NEB的catalog确实是一本分子克隆的好书。在国内虽然是作分子生物学出生，克隆没少
: 作，但来美国作博士后，要作knockout construct时，才真正变成cloning expert：
: pUC18里要塞进一个20kb的片断，找合适的restriction enzyme都困难呀。记得当时就
: 一个Not I是识别八个bp的酶，很有用，另一个是Sal I。Sal I是识别六个bp,但在老鼠
: genome里，不知什么原因，位点很少，几个constructs的最后一步，三片断连接都是两
: 边用Sal I和中间另一个酶。有一个cloning strategy, 整整两天都没有想出来，只好
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c********n
发帖数: 225 | 27 谈谈和蛋白打交道的日子 （一）
序
笔者已经做了多年和蛋白相关的科研与服务，产品研发生产以及产业化。在这里分享一
下与蛋白打交道这些年带来的一些感想。其实所有的科学研究都是用来解决人类已经和
即将遇到的各种各样的问题的，只有解决了问题才会有更大的存在价值。
第一篇 DNA测序， Sanger Style - 纪念Frederick Sanger
2013年11月20号，Frederick Sanger 去世了， 享年95岁。Sanger是DNA测序之父，获
得过两次诺贝尔奖， 一个是1958年蛋白测序， 另一个是1980年DNA测序。虽然DNA结构
发现的比蛋白晚， 但毕竟是genetic code，master script。ATCG四个碱基的组合比蛋
白的20个氨基酸的天文数字组合可更容易研究找规律了。人天生就是个好奇的动物，
最喜欢找规律, 尤其喜欢从简单的地方入手，所以围绕DNA的研究在Watson-Crick的碱
基配对这个简单地规律被发现以后，起来的就比蛋白快了很多。其实DNA和蛋白， 就像
是帅才和将才， 他们的用处是不同的，需要出色的帅才（DNA）订好了方向，能干的将
才（蛋白）来实现这个宏伟蓝图， 中间再加上很多配合和实时的调整执行。当然这个
比喻是大大简化了复杂的生命规律。这样想想，Sanger大师就更高一筹了，把分析这些
分子水平的帅和将的方法非常简洁的给搞定了， 而简单的通常就是最好的。随后人类
基因测序也是靠着Sanger sequencing完成的， Sanger大师也就间接地把生活中的帅和
将- Bill Clinton， J Craig Venter和Francis Collins等人，通过这个人类基因组测
序推到了风口浪尖上。到现在随着技术的发展和革新，各种形式的测序可是每个做生物
实验的人必须用到的？有多少公司也是这样年复一年的养了不少人。测序这个技术推动
了生命科学的进展， 也造就了很多商业精英， 这个读一读J Craig Venter的A Life
Decoded会发现很多有趣的描述。读的时候别忘了带上自己的过滤镜， 可别被这个Jobs
级别的reality distortion的大师给忽悠的太厉害。
世界上最好的赞美是来自于曾经的对手。Sanger 和 Venter在human genome信息公开化
上面是有过不少公开的争议的， 也算是对手吧。J Craig Venter在2013年11月20日这
天 是这样在twitter上评价 Sanger的：
One of the most important scientists of the 20th century! Fred Sanger has
died. He twice changed the direction of the scientific world.
— J. Craig Venter (@JCVenter) November 20, 2013
为了纪念Sanger大师的贡献， 这里我回顾一下当年和DNA 测序有关的一些趣事。
那年我需要在大肠杆菌里面表达和纯化一个100kDa的蛋白， 然后做它的NMR结构研究。
这个可不是个小事情， 很多师兄师姐听说了都闪了。我觉得100这个数字不错， 就很
兴奋地接了下来。当然，这个蛋白也就成了一辈子总记挂着的一个事情。就像一些人和
事，平时可能不常想着， 但是到了思绪比较安静的时候，就会在不经意之间出现在你
的flash记忆里， 而且随着时间的推移，会给你不同的苦辣酸甜的感受。好啦， 回到
测序。 刚接到这个100kDa蛋白项目的时候，是从一个刚拿到tenure track position的
前辈手里继承下来的。 前辈的笔记写的非常清晰， 用了一个一共五步的cloning
procedure， 包括 mung bean nuclease treatment，好几个restriction enzyme的不
同组合， 好fancy！现在这些就交给个基因合成公司就可以解决的小case， 当时看起
来和做起来可是心潮澎湃的事情。我把前辈的笔记抱着看了一遍又一遍，restriction
enzyme就看那时的NEB catalogue。NEB的restriction enzyme是由另一个诺贝尔大师
Richard J Roberts领导做的， 他们的catalogue可是我们几个人研究restriction
enzyme的宝典，从头到尾看个一字不漏； 这样的宝典如今可是不多见了， 到现在我还
保留着一份， 真是经典。
看完了前辈的笔记， 对他是佩服的五体投地， 这么复杂精密的设计， 我可是永远也
不会想出来的。表达clone就在自己一步步精心follow前辈的笔记中拿到了。下面是测
序。当年可是要手工同位素35S 测序的，要花不少时间。自己是个急脾气的人，决定表
达和测序同时进行。可是蛋白表达没有结果！怎么会这样呢？于是就静一静心， 踏实
开始了测序。测序的胶是要自己制备的。制备胶的玻璃板子要清洗的非常干净，用酒精
再擦拭一遍， 然后涂上silicone coating。 灌胶时是不能出任何气泡的， 否则一张
大胶就报废了。 这可是好几个小时的工作， 也是个体力活。 跟在postdoc师兄后面看
了几次以后，自己第一次做是在一个夏天。早上先看了几遍实验流程， 又和师兄讨论
了一下， 把所有的原材料都准备好， 每个部件整齐归位， 就开始了。 第一张胶铺得
很顺利，心里美极了， 叫来了师兄， 想听他称赞几句。哎，师兄有火眼金睛， 一下
就看到了一个非常细小的气泡。不行， 重来。 好吧， 就到午饭时间了， 心情还不是
太坏， 还有一个下午呢， 没问题。吃完午饭， 从头再来，这次感觉像个大师。 可是
大师失手了， 这次的气泡自己都能一眼看见！没有和师兄说， 就决定再来一次。第三
次就着急了，开始就不顺利， 结果当然也不好。 晚饭时间到了，心情可是比较糟糕的
。 师兄说没事的， 明天再来吧。自己明天还有个TA要做准备（我们系每个RA研究生必
须要做两门课的免费TA）， 就先放下了这个胶的事情。
可是到了晚上别的事情都做完了， 自己很不甘心， 决定回实验室把这个胶铺好。这样
第二天就可以测序了。就又回到实验室，开始了铺胶。第一次做完有一个小气泡。已经
到凌晨了， 回家呢还是接着做？嗯， 接着做。又做了几遍不记得了，最后很成功，
一个气泡也没有！功夫不负有心人。这时看看表已经是早上5点多了。Bus没有了，就走
路回家。 直到今天都还可以感受到那个夏天清晨清凉的空气的的味道。中间要路过一
个学校养鸡场， 是做IgY抗体用的。那天黎明的鸡鸣声就好像是在给自己打气。回家睡
了不到三个小时又回到实验室，那天的Sanger DNA测序是成功的。
所有实验都是要经过不同的磨难的。DNA测序结果出来了，有一个frame shift。这就是
蛋白没有表达的原因吧？自己哪里做错了？于是又回去查笔记， 一个个碱基的对， 真
是的， 前辈设计精密的步骤里果然藏着个frame shift。怎么办呢？就去打电话问前辈
， 前辈信心满满， 绝对没有问题的， 怎么会有问题呢？好吧，咬咬牙，自己想办法
。于是， 找到另一个师兄， 请他帮看看。 这个师兄有着完全不同的做事方法， 喜欢
简单， 一下子给设计了一个非常简便的方法，找到两个restriction enzyme，先用
wild type template把clone里有frame shift的一段给PCR出来正确的，再re-clone 替
换。拿到clone以后决定还是蛋白表达和测序同时进行省时间。 这次蛋白可是表达出来
了！又做了不少DNA 测序来证明clone真的是正确的。 这一番折腾之后，感觉自己是分
子生物的熟手了， 也不盲目的崇拜前辈们了。 从此，每一个实验都要自己认真看几遍
实验流程， 不管是谁设计的。 而且，每次都想， 有没有更简单的方法呢？ 简单能做
到的，总是最好的。
现在DNA测序早已经是放到信封里等email 数据回来的年代了。Restriction enzyme也
一度不是那么风光了。可是风水总是轮流转的， 就像fashion也总是会隔几十年再回来
。现在Synthetic biology等新兴领域又把这些尘封的经典们搬出来晒太阳。前一次参
加Synthetic biology大会， 遇到了好几个非常年轻的物理系和工程系来做生物的学生
。 他们对restriction enzyme和Sanger DNA 测序表现出来的小孩子见到糖果般的好奇
与痴迷， 以及对于自己亲手做出来的这些实验的经验分享，和他们眼神里的那种兴奋
， 足以让Sanger老先生在天上也会满足的微笑了吧。
经典是永远不会过时的。
CoinbyCoin
2013 圣诞 |
f**u
发帖数: 346 | |
s******s
发帖数: 13035 | 29 亲手测过序列的都是老前辈了。我是只看到过设备和大板，
从没有自己测过。做学生的时候每次看到无数大牛的毕业论文
标题就是xxx基因的克隆和测序，顿时心向往之。。。
【在 c********n 的大作中提到】
: 谈谈和蛋白打交道的日子 （一）
: 序
: 笔者已经做了多年和蛋白相关的科研与服务，产品研发生产以及产业化。在这里分享一
: 下与蛋白打交道这些年带来的一些感想。其实所有的科学研究都是用来解决人类已经和
: 即将遇到的各种各样的问题的，只有解决了问题才会有更大的存在价值。
: 第一篇 DNA测序， Sanger Style - 纪念Frederick Sanger
: 2013年11月20号，Frederick Sanger 去世了， 享年95岁。Sanger是DNA测序之父，获
: 得过两次诺贝尔奖， 一个是1958年蛋白测序， 另一个是1980年DNA测序。虽然DNA结构
: 发现的比蛋白晚， 但毕竟是genetic code，master script。ATCG四个碱基的组合比蛋
: 白的20个氨基酸的天文数字组合可更容易研究找规律了。人天生就是个好奇的动物，
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T****u
发帖数: 424 | |
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f****h
发帖数: 20 | 31 景仰前辈！现在已经很难想象没有商业化测序，没有基因合成的话实验要怎么做。 |
j*****9
发帖数: 716 | |
g*****p
发帖数: 451 | 33 能这样写东西的写手们都快死绝了
楼主一定要坚持住！
另外一个建议，把你的实验内容写详细点
这样便于大家了解实验流程，对刚入门的学生的实验设计会帮助很大的
我正好给学生们开生物史的课，很有兴趣读楼主的东西
讲课的时候也可以多掰点花边新闻
【在 c********n 的大作中提到】
: 谈谈和蛋白打交道的日子 （一）
: 序
: 笔者已经做了多年和蛋白相关的科研与服务，产品研发生产以及产业化。在这里分享一
: 下与蛋白打交道这些年带来的一些感想。其实所有的科学研究都是用来解决人类已经和
: 即将遇到的各种各样的问题的，只有解决了问题才会有更大的存在价值。
: 第一篇 DNA测序， Sanger Style - 纪念Frederick Sanger
: 2013年11月20号，Frederick Sanger 去世了， 享年95岁。Sanger是DNA测序之父，获
: 得过两次诺贝尔奖， 一个是1958年蛋白测序， 另一个是1980年DNA测序。虽然DNA结构
: 发现的比蛋白晚， 但毕竟是genetic code，master script。ATCG四个碱基的组合比蛋
: 白的20个氨基酸的天文数字组合可更容易研究找规律了。人天生就是个好奇的动物，
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m*********D
发帖数: 1727 | 34 哈哈，是啊，sequencing gel跑了多年，压那些X-光片，都是美好的回忆。
读博士的时候，在国内给Bio-rad纯化一种高温DNA polymerase，能解决sequecing反应
时不少二级结构的问题，还挣过几千外快呢。S-35是后来的吧，记得前面用p-32，后来
是P-33，再到S-35。
NEB的catalog确实是一本分子克隆的好书。在国内虽然是作分子生物学出生，克隆没少
作，但来美国作博士后，要作knockout construct时，才真正变成cloning expert：
pUC18里要塞进一个20kb的片断，找合适的restriction enzyme都困难呀。记得当时就
一个Not I是识别八个bp的酶，很有用，另一个是Sal I。Sal I是识别六个bp,但在老鼠
genome里，不知什么原因，位点很少，几个constructs的最后一步，三片断连接都是两
边用Sal I和中间另一个酶。有一个cloning strategy, 整整两天都没有想出来，只好
周末放弃了，去钓鱼，突然想出来的。那时候NEB catalog是比Molecular Cloning还重
要的书--restriction enzyme的甲基化，不同酶的中间四个bp的相容性，NEB四个
buffer和不同酶的活性，是每天都要翻阅的。
正是那两年作knock-out construccts的经历为现在这个饭碗打下了基础。tissue
culture是从ES cell培养开始的。有了作knockout conotstructs 和ES cell的经验，
进现在工作的这个实验室后，十多年基本上没有任何难倒我的bench work。开始一年老
板还不相信俺的手，一年后，无论是tissue culture还是cloning，实验室学生碰到问
题，老板都让他们找我。这两项就是我工作的保障啊。
不作cloning都快十年了，restriction enzyme也很难得用到了，偶尔学生会来问问，
还能带来一些美好的回忆。前年毕业的一个学生，在实验室作了六年也没碰过cloning
。毕业临走的时候听说我是当年的克隆高手，特地让我给她讲了一小时的课。只是那些
cloning技术现在已经没有多少用武之地了。
老了老了。女儿走出大学校门第一年就比我这个博士后老爸工资高不少。这几天女儿过
节回家，和她聊天，说她学CS赶上了好时候。2001年前后那段日子，CS毕业生难找工作
，好几个我写过推荐信进CS读master的叔叔阿姨们当时也是走投无路呢。今天他们都不
错，比我这个生物老博士后混得好多了。不过，咱也满足了，再混个五到十年，儿子进
了大学，咱完成了作父母的责任，也就不必为五斗折腰了。可以和太太在蓝天碧水间逍
遥，钓鱼种菜为生。 |
t*****w
发帖数: 254 | 35 I can see the sophisticated science here. Unfortunately, biology salary is
nowhere to compete with computer's.
【在 m*********D 的大作中提到】
: 哈哈，是啊，sequencing gel跑了多年，压那些X-光片，都是美好的回忆。
: 读博士的时候，在国内给Bio-rad纯化一种高温DNA polymerase，能解决sequecing反应
: 时不少二级结构的问题，还挣过几千外快呢。S-35是后来的吧，记得前面用p-32，后来
: 是P-33，再到S-35。
: NEB的catalog确实是一本分子克隆的好书。在国内虽然是作分子生物学出生，克隆没少
: 作，但来美国作博士后，要作knockout construct时，才真正变成cloning expert：
: pUC18里要塞进一个20kb的片断，找合适的restriction enzyme都困难呀。记得当时就
: 一个Not I是识别八个bp的酶，很有用，另一个是Sal I。Sal I是识别六个bp,但在老鼠
: genome里，不知什么原因，位点很少，几个constructs的最后一步，三片断连接都是两
: 边用Sal I和中间另一个酶。有一个cloning strategy, 整整两天都没有想出来，只好
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o******n
发帖数: 511 | |
c**********n
发帖数: 177 | 37 I can feel the sophisticated algorithms in your mind. Unfortunately, IT
salary is nowhere to compete with a stock broker.
【在 t*****w 的大作中提到】
: I can see the sophisticated science here. Unfortunately, biology salary is
: nowhere to compete with computer's.
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c**********n
发帖数: 177 | |
c********n
发帖数: 225 | 39 谢谢大家的支持
答复midwestPstD：
- 羡慕你的green thumb；
这个也是像学会自行车一样， 一旦领悟， 就不会丢掉了， 即使多年不骑车。
答复tankerw：
关于IT和生物的一些讨论， 很有意思。 其实IT也是经历起伏的；
生物这个行业生命力是很持久的；以后针对这个命题我也想想给一些实例出来 |
T**********2
发帖数: 38 | 40 曾经银染过测序胶的路过。
手工测序，制胶、跑胶、显影（同位素或非放）都不是问题，真正难的是读序，尤其是
读到密集的地方，有时还有band compression, G4 trap等。一个反应要读出尽可能长
的序列，往往读花了眼。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 41 以前clone的trick真是多。做phd得时候，有一个实在
找不到合适单切的载体，随口一提，老板说可以加EB切，
以前闻所未闻啊
【在 m*********D 的大作中提到】
: 哈哈，是啊，sequencing gel跑了多年，压那些X-光片，都是美好的回忆。
: 读博士的时候，在国内给Bio-rad纯化一种高温DNA polymerase，能解决sequecing反应
: 时不少二级结构的问题，还挣过几千外快呢。S-35是后来的吧，记得前面用p-32，后来
: 是P-33，再到S-35。
: NEB的catalog确实是一本分子克隆的好书。在国内虽然是作分子生物学出生，克隆没少
: 作，但来美国作博士后，要作knockout construct时，才真正变成cloning expert：
: pUC18里要塞进一个20kb的片断，找合适的restriction enzyme都困难呀。记得当时就
: 一个Not I是识别八个bp的酶，很有用，另一个是Sal I。Sal I是识别六个bp,但在老鼠
: genome里，不知什么原因，位点很少，几个constructs的最后一步，三片断连接都是两
: 边用Sal I和中间另一个酶。有一个cloning strategy, 整整两天都没有想出来，只好
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c********n
发帖数: 225 | 42 回复 Teletubbies2
- 是的，很多步骤；
- Lloyd Smith这个学物理的来搞生物，就是因为头疼这些难处，
才想法子做的DNA sequencer |
c********n
发帖数: 225 | 43 回复 shakuras
-是的；
-看看Ham Smith； Daniel G. Gibson； J Craig Venter 他们制造synthetic
organism的方法， 用了不少经典； |
c*********r
发帖数: 1046 | 44 文笔真好，等待下文。
我也铺过测序胶，，佩服LZ！ |
B*H
发帖数: 2158 | 45 牛！
看着真象教科书级别的。只有做生物的才能有体会。 |
m**********v
发帖数: 33 | 46 这也许就是大部分千老们的归宿吧。感慨万千啊。
【在 m*********D 的大作中提到】
: 哈哈，是啊，sequencing gel跑了多年，压那些X-光片，都是美好的回忆。
: 读博士的时候，在国内给Bio-rad纯化一种高温DNA polymerase，能解决sequecing反应
: 时不少二级结构的问题，还挣过几千外快呢。S-35是后来的吧，记得前面用p-32，后来
: 是P-33，再到S-35。
: NEB的catalog确实是一本分子克隆的好书。在国内虽然是作分子生物学出生，克隆没少
: 作，但来美国作博士后，要作knockout construct时，才真正变成cloning expert：
: pUC18里要塞进一个20kb的片断，找合适的restriction enzyme都困难呀。记得当时就
: 一个Not I是识别八个bp的酶，很有用，另一个是Sal I。Sal I是识别六个bp,但在老鼠
: genome里，不知什么原因，位点很少，几个constructs的最后一步，三片断连接都是两
: 边用Sal I和中间另一个酶。有一个cloning strategy, 整整两天都没有想出来，只好
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m*********D
发帖数: 1727 | 47 哈哈，还好啦。人总是要老去的。
五年前和实验室的一个Ph.D./M.D.学生合作一个课题，等上了路，学生死活不让我插手
了，怕bench上作不过我，他毕不了业。老板和我长谈了几次，最后我去开辟新战场。
五年了，小伙子利用自己在IT上面的长处，把课题从纯粹的生物推到了Bioinformatics
上，把bench上的结果和public-available的micro-array data结合起来，给实验室开
辟了一个新的方向。
【在 m**********v 的大作中提到】
: 这也许就是大部分千老们的归宿吧。感慨万千啊。
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w***r
发帖数: 709 | 48 感动ing
【在 c********n 的大作中提到】
: 谈谈和蛋白打交道的日子 （一）
: 序
: 笔者已经做了多年和蛋白相关的科研与服务，产品研发生产以及产业化。在这里分享一
: 下与蛋白打交道这些年带来的一些感想。其实所有的科学研究都是用来解决人类已经和
: 即将遇到的各种各样的问题的，只有解决了问题才会有更大的存在价值。
: 第一篇 DNA测序， Sanger Style - 纪念Frederick Sanger
: 2013年11月20号，Frederick Sanger 去世了， 享年95岁。Sanger是DNA测序之父，获
: 得过两次诺贝尔奖， 一个是1958年蛋白测序， 另一个是1980年DNA测序。虽然DNA结构
: 发现的比蛋白晚， 但毕竟是genetic code，master script。ATCG四个碱基的组合比蛋
: 白的20个氨基酸的天文数字组合可更容易研究找规律了。人天生就是个好奇的动物，
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h********0
发帖数: 12056 | 49 精彩！
【在 c********n 的大作中提到】
: 谈谈和蛋白打交道的日子 （一）
: 序
: 笔者已经做了多年和蛋白相关的科研与服务，产品研发生产以及产业化。在这里分享一
: 下与蛋白打交道这些年带来的一些感想。其实所有的科学研究都是用来解决人类已经和
: 即将遇到的各种各样的问题的，只有解决了问题才会有更大的存在价值。
: 第一篇 DNA测序， Sanger Style - 纪念Frederick Sanger
: 2013年11月20号，Frederick Sanger 去世了， 享年95岁。Sanger是DNA测序之父，获
: 得过两次诺贝尔奖， 一个是1958年蛋白测序， 另一个是1980年DNA测序。虽然DNA结构
: 发现的比蛋白晚， 但毕竟是genetic code，master script。ATCG四个碱基的组合比蛋
: 白的20个氨基酸的天文数字组合可更容易研究找规律了。人天生就是个好奇的动物，
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c********n
发帖数: 225 | 50 回复 MidwestPstD
高风亮节。赞一个
新年快乐 |
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b****r
发帖数: 17995 | |
l**********1
发帖数: 5204 | 52 Dozen Ys ago,
auto sequencer ABI Prism 3100 or 3700
15 Ys ago ABI 310 or 373 already didn't use Sanger isotope labelling..
Pls refer,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10220426
Ps:
matrix used almost above types then..
【在 m*********D 的大作中提到】
: 哈哈，是啊，sequencing gel跑了多年，压那些X-光片，都是美好的回忆。
: 读博士的时候，在国内给Bio-rad纯化一种高温DNA polymerase，能解决sequecing反应
: 时不少二级结构的问题，还挣过几千外快呢。S-35是后来的吧，记得前面用p-32，后来
: 是P-33，再到S-35。
: NEB的catalog确实是一本分子克隆的好书。在国内虽然是作分子生物学出生，克隆没少
: 作，但来美国作博士后，要作knockout construct时，才真正变成cloning expert：
: pUC18里要塞进一个20kb的片断，找合适的restriction enzyme都困难呀。记得当时就
: 一个Not I是识别八个bp的酶，很有用，另一个是Sal I。Sal I是识别六个bp,但在老鼠
: genome里，不知什么原因，位点很少，几个constructs的最后一步，三片断连接都是两
: 边用Sal I和中间另一个酶。有一个cloning strategy, 整整两天都没有想出来，只好
|
s*****g
发帖数: 7857 | 53 “又做了几遍不记得了，最后很成功，
一个气泡也没有！功夫不负有心人。这时看看表已经是早上5点多了。Bus没有了，就走
路回家。 直到今天都还可以感受到那个夏天清晨清凉的空气的的味道。中间要路过一
个学校养鸡场， 是做IgY抗体用的。那天黎明的鸡鸣声就好像是在给自己打气。回家睡
了不到三个小时又回到实验室，那天的Sanger DNA测序是成功的。”
天道酬勤！
你的师兄们和前辈们给你这个勤奋，有悟性，会变通的人很好的training!
【在 c********n 的大作中提到】
: 谈谈和蛋白打交道的日子 （一）
: 序
: 笔者已经做了多年和蛋白相关的科研与服务，产品研发生产以及产业化。在这里分享一
: 下与蛋白打交道这些年带来的一些感想。其实所有的科学研究都是用来解决人类已经和
: 即将遇到的各种各样的问题的，只有解决了问题才会有更大的存在价值。
: 第一篇 DNA测序， Sanger Style - 纪念Frederick Sanger
: 2013年11月20号，Frederick Sanger 去世了， 享年95岁。Sanger是DNA测序之父，获
: 得过两次诺贝尔奖， 一个是1958年蛋白测序， 另一个是1980年DNA测序。虽然DNA结构
: 发现的比蛋白晚， 但毕竟是genetic code，master script。ATCG四个碱基的组合比蛋
: 白的20个氨基酸的天文数字组合可更容易研究找规律了。人天生就是个好奇的动物，
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