x******o
发帖数: 76 | 1 想把6kb片段连进8.5kb的lentiviral vector里，试了几次都不成功，求助一下。
我是这么做的，单酶切得到6kb insert，切胶纯化，载体单酶切，去磷酸化，切胶纯化
。1:1比例4度连接过夜，转化stbl3感受态42度45秒，recover 1小时涂版，30度过夜，
板子上长几十个斑。挑斑入LB+amp 30度摇过夜，miniprep，酶切鉴定。跑胶时，总是
得到大概2kb的片段，无论是否酶切过。拿最近的一次质粒直接跑胶结果来看，12个克
隆，9个是2kb band，2个是degraded DNA（1-2kb size），1个是5kb左右（经酶切鉴定
可能是contamination）。 现在基本怀疑是LTR重组导致片段丢失，觉得自己已经考虑
了很多可能导致LTR重组的因素，所以只能问问大伙有什么建议。 |
j******i
发帖数: 939 | 2 你用的是什么ligase啊。T4 ligase应该是16度或者室温啊。另外，如果是粘末端可以
试一试T7 ligase. 鉴定克隆的时候，用cloning PCR更方便，便宜。 |
x******o
发帖数: 76 | 3 是T4，16度和室温都试过了，没太大区别。关键是这个2kb的带，解决不了。
【在 j******i 的大作中提到】
: 你用的是什么ligase啊。T4 ligase应该是16度或者室温啊。另外，如果是粘末端可以
: 试一试T7 ligase. 鉴定克隆的时候，用cloning PCR更方便，便宜。
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a*******a
发帖数: 4233 | 4 换感受态
【在 x******o 的大作中提到】
: 想把6kb片段连进8.5kb的lentiviral vector里，试了几次都不成功，求助一下。
: 我是这么做的，单酶切得到6kb insert，切胶纯化，载体单酶切，去磷酸化，切胶纯化
: 。1:1比例4度连接过夜，转化stbl3感受态42度45秒，recover 1小时涂版，30度过夜，
: 板子上长几十个斑。挑斑入LB+amp 30度摇过夜，miniprep，酶切鉴定。跑胶时，总是
: 得到大概2kb的片段，无论是否酶切过。拿最近的一次质粒直接跑胶结果来看，12个克
: 隆，9个是2kb band，2个是degraded DNA（1-2kb size），1个是5kb左右（经酶切鉴定
: 可能是contamination）。 现在基本怀疑是LTR重组导致片段丢失，觉得自己已经考虑
: 了很多可能导致LTR重组的因素，所以只能问问大伙有什么建议。
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j******i
发帖数: 939 | 5 6kb插到8kb是很难的，这不是个别现象。可以尝试高溶度的t4 ligase（biolab), t7
ligase, Gibbson Assembly.
【在 x******o 的大作中提到】
: 是T4，16度和室温都试过了，没太大区别。关键是这个2kb的带，解决不了。
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x******o
发帖数: 76 | 6 换什么感受态？
【在 a*******a 的大作中提到】
: 换感受态
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s******s
发帖数: 13035 | 7 要么试试不要磷酸化，直接多加5倍insertion连，然后用96孔板pcr检测insertion
【在 x******o 的大作中提到】
: 想把6kb片段连进8.5kb的lentiviral vector里，试了几次都不成功，求助一下。
: 我是这么做的，单酶切得到6kb insert，切胶纯化，载体单酶切，去磷酸化，切胶纯化
: 。1:1比例4度连接过夜，转化stbl3感受态42度45秒，recover 1小时涂版，30度过夜，
: 板子上长几十个斑。挑斑入LB+amp 30度摇过夜，miniprep，酶切鉴定。跑胶时，总是
: 得到大概2kb的片段，无论是否酶切过。拿最近的一次质粒直接跑胶结果来看，12个克
: 隆，9个是2kb band，2个是degraded DNA（1-2kb size），1个是5kb左右（经酶切鉴定
: 可能是contamination）。 现在基本怀疑是LTR重组导致片段丢失，觉得自己已经考虑
: 了很多可能导致LTR重组的因素，所以只能问问大伙有什么建议。
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a*******a
发帖数: 4233 | 8 你做其他lenti克隆有问题么？
你的对照板是重组么？
我用dh5a做过几十个，基本上都是8k载体3-8k片段，也有三片段连，没出过问题。也没
觉得特别不好连
【在 x******o 的大作中提到】
: 换什么感受态？
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l******a
发帖数: 3339 | 9 试试别的e coli strain， stbl3是endA+，不好handle，有可能你的dna被降解了
【在 x******o 的大作中提到】
: 想把6kb片段连进8.5kb的lentiviral vector里，试了几次都不成功，求助一下。
: 我是这么做的，单酶切得到6kb insert，切胶纯化，载体单酶切，去磷酸化，切胶纯化
: 。1:1比例4度连接过夜，转化stbl3感受态42度45秒，recover 1小时涂版，30度过夜，
: 板子上长几十个斑。挑斑入LB+amp 30度摇过夜，miniprep，酶切鉴定。跑胶时，总是
: 得到大概2kb的片段，无论是否酶切过。拿最近的一次质粒直接跑胶结果来看，12个克
: 隆，9个是2kb band，2个是degraded DNA（1-2kb size），1个是5kb左右（经酶切鉴定
: 可能是contamination）。 现在基本怀疑是LTR重组导致片段丢失，觉得自己已经考虑
: 了很多可能导致LTR重组的因素，所以只能问问大伙有什么建议。
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x******o
发帖数: 76 | 10 做短片段（1-2kb）的没太大问题，2kb的情况出现几率比较小，偶尔会有，没太留意。
对照板是指vector only吗？只有几个斑，没有挑过。
我以前dh5a和stbl3都用过，做短的没问题，最近做长insert总是做不出来。也许试试
换个batch感受态?
【在 a*******a 的大作中提到】
: 你做其他lenti克隆有问题么？
: 你的对照板是重组么？
: 我用dh5a做过几十个，基本上都是8k载体3-8k片段，也有三片段连，没出过问题。也没
: 觉得特别不好连
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x******o
发帖数: 76 | 11 给推荐一个 ？
【在 l******a 的大作中提到】
: 试试别的e coli strain， stbl3是endA+，不好handle，有可能你的dna被降解了
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x******o
发帖数: 76 | 12 gibbson不考虑了，insert太长，不想再pcr测序
我试试T7吧。相对于T4，T7是对stick end的完整程度要求不高，我理解的对吧？
不过我总觉得连接不是最主要的问题，再怎么连接不好也不会出现大量的2kb现象吧。
【在 j******i 的大作中提到】
: 6kb插到8kb是很难的，这不是个别现象。可以尝试高溶度的t4 ligase（biolab), t7
: ligase, Gibbson Assembly.
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c****u
发帖数: 584 | 13 NEB turbo
【在 x******o 的大作中提到】
: 给推荐一个 ？
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M******g
发帖数: 152 | 14 stbl3 is really bad comp cell.
try neb stable comp cells.
gibbson assembly is a good choice. use Q5 polymerase, which has very high
fidelity. |
q******g
发帖数: 3858 | 15 stbl3大量表达的时候用。转染还是用DH5a,拿到质粒后，在转到stbl3。 |
x******o
发帖数: 76 | 16 可是PCR之后不是还要测序6kb吗？
【在 M******g 的大作中提到】
: stbl3 is really bad comp cell.
: try neb stable comp cells.
: gibbson assembly is a good choice. use Q5 polymerase, which has very high
: fidelity.
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x******o
发帖数: 76 | 17 试过DH5a也做不出来，而且DH5a难道不是不适合做unstable clone吗？
我觉得主要问题可能是LTR之间片段丢失，所以总是得到小片段的质粒（2kb）。
我的LTR之间有10kb长，是不是太大了？
【在 q******g 的大作中提到】
: stbl3大量表达的时候用。转染还是用DH5a,拿到质粒后，在转到stbl3。
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M******g
发帖数: 152 | 18 sequencing is so cheap and easy nowadays.
I have cloned a 6.3 kb gene using Q5 pcr and seen no mutations. I love Q5
and gibson assembly. highly recommend them to you.
【在 x******o 的大作中提到】
: 可是PCR之后不是还要测序6kb吗？
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