B***v
发帖数: 113 | 1 我打算做个DNA transfection，不同于传统的plasmid，我打算用最小的DNA片段
promoter--kozak--ORF (ATG to TGA)
这个是不是就可以了？有神么问题没？蛋白表达会不会受影响？ |
j*******u
发帖数: 81 | 2 同问
【在 B***v 的大作中提到】
: 我打算做个DNA transfection，不同于传统的plasmid，我打算用最小的DNA片段
: promoter--kozak--ORF (ATG to TGA)
: 这个是不是就可以了？有神么问题没？蛋白表达会不会受影响？
|
i***l
发帖数: 1656 | 3 3' UTR is important for mRNA stability
【在 B***v 的大作中提到】
: 我打算做个DNA transfection，不同于传统的plasmid，我打算用最小的DNA片段
: promoter--kozak--ORF (ATG to TGA)
: 这个是不是就可以了？有神么问题没？蛋白表达会不会受影响？
|
B***v
发帖数: 113 | 4 你这个想法很好，但是出于把DNA片段做的越小越好的前提，我可能不会加入3' UTR了。
而且日常很多克隆表达都没有3' UTR只有ORF，貌似业没有太大的表达问题。
没有promoter是肯顶不行的我想。
【在 i***l 的大作中提到】
: 3' UTR is important for mRNA stability
|
h******y
发帖数: 351 | 5 你这思路就是 Minicircle DNA Vector
https://www.systembio.com/minicircle-dna-vectors/overview
【在 B***v 的大作中提到】
: 我打算做个DNA transfection，不同于传统的plasmid，我打算用最小的DNA片段
: promoter--kozak--ORF (ATG to TGA)
: 这个是不是就可以了？有神么问题没？蛋白表达会不会受影响？
|
c**i
发帖数: 265 | 6 没有polyA, ribosome不能被recruit，无法翻译
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 11
【在 B***v 的大作中提到】
: 我打算做个DNA transfection，不同于传统的plasmid，我打算用最小的DNA片段
: promoter--kozak--ORF (ATG to TGA)
: 这个是不是就可以了？有神么问题没？蛋白表达会不会受影响？
|
n******e
发帖数: 89 | 7 是想解决转染效率不高的问题？看着好像只是表达一个蛋白，整个质粒也没有那么大吧
？有可能做小了效率不见得提高很多，可能和细胞种类的关系更大。
【在 B***v 的大作中提到】
: 我打算做个DNA transfection，不同于传统的plasmid，我打算用最小的DNA片段
: promoter--kozak--ORF (ATG to TGA)
: 这个是不是就可以了？有神么问题没？蛋白表达会不会受影响？
|
B***v
发帖数: 113 | 8 你提醒的好，多谢。我今天也想到了，polyA是需要的，所以我打算在末端加个hGH
poly(A), 600+ bp, 好大啊。不过没有恐怕不行。
ribosome结合位点在promoter区域吧？polyA的作用是nuclear export和stabilize
mRNA，我记得。
【在 c**i 的大作中提到】
: 没有polyA, ribosome不能被recruit，无法翻译
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 11
|
B***v
发帖数: 113 | 9 你这个有点意思，我头一次听说，3kb确实很小，比我现在加个polyA之后1.9kb也大不
了台多。我研究一下。Minicircle DNA应该稳定性更好？转录效率更高？
【在 h******y 的大作中提到】
: 你这思路就是 Minicircle DNA Vector
: https://www.systembio.com/minicircle-dna-vectors/overview
|
B***v
发帖数: 113 | 10 不是解决转染效率不高的问题，否则我可以用病毒载体。
【在 n******e 的大作中提到】
: 是想解决转染效率不高的问题？看着好像只是表达一个蛋白，整个质粒也没有那么大吧
: ？有可能做小了效率不见得提高很多，可能和细胞种类的关系更大。
|
|
|
h******y
发帖数: 351 | 11 minicircle DNA的优势主要有两点。一是size小，转染效率高。二是最主要的，因为去
除了在bacterial中复制和筛选所需要的细菌DNA元件，从而降低了在真核细胞中被识别
成异源而排除的几率。有的minicircle DNA上加了S/MAR元件，从而可以以episome的形
式在细胞中长期存在，实现外源基因的长时表达。
【在 B***v 的大作中提到】
: 你这个有点意思，我头一次听说，3kb确实很小，比我现在加个polyA之后1.9kb也大不
: 了台多。我研究一下。Minicircle DNA应该稳定性更好？转录效率更高？
|
B***v
发帖数: 113 | 12 谢谢。学习了。
【在 h******y 的大作中提到】
: minicircle DNA的优势主要有两点。一是size小，转染效率高。二是最主要的，因为去
: 除了在bacterial中复制和筛选所需要的细菌DNA元件，从而降低了在真核细胞中被识别
: 成异源而排除的几率。有的minicircle DNA上加了S/MAR元件，从而可以以episome的形
: 式在细胞中长期存在，实现外源基因的长时表达。
|
B***v
发帖数: 113 | 13 我现在想我可能不需要minicircle DNA, 我只需要把我的construct (promoter-insert
-polyA)两端加上黏性末端连成circle DNA就行了。我给这个公司打电话了，
minicircle DNA backbone有1.2 kb, 如果我直接连起来连这个1.2 kb都没有，更小。
就是不知道这两种format哪个表达更好
linear promoter-insert-polyA vs. circular promoter-insert-polyA
【在 h******y 的大作中提到】
: minicircle DNA的优势主要有两点。一是size小，转染效率高。二是最主要的，因为去
: 除了在bacterial中复制和筛选所需要的细菌DNA元件，从而降低了在真核细胞中被识别
: 成异源而排除的几率。有的minicircle DNA上加了S/MAR元件，从而可以以episome的形
: 式在细胞中长期存在，实现外源基因的长时表达。
|
j****x
发帖数: 1704 | 14 minicircle DNA的“backbone”只有几十bp，就只是两个重组臂的残留序列而已，你说
的1.2kb指的是parental plasmid，在最终的mcDNA里面是没有的。
线性片段不是不可以，但有几个问题：
1. 线性DNA的转染效率会显著低于超螺旋结构的DNA。
2. 细胞内的稳定性显著低于超螺旋闭环DNA，因为对DNase更敏感，更容易被降解。
3. 缺少稳定的大量制备方法（PCR？）
insert
【在 B***v 的大作中提到】
: 我现在想我可能不需要minicircle DNA, 我只需要把我的construct (promoter-insert
: -polyA)两端加上黏性末端连成circle DNA就行了。我给这个公司打电话了，
: minicircle DNA backbone有1.2 kb, 如果我直接连起来连这个1.2 kb都没有，更小。
: 就是不知道这两种format哪个表达更好
: linear promoter-insert-polyA vs. circular promoter-insert-polyA
|
B***v
发帖数: 113 | 15 关于minicircle DNA的“backbone”我打电话问这个公司了，https://www.systembio.
com/，他们说1.2 kbp的backbone，不是parental，我觉得是可以更小的，但他们就这
么说的，我的insert 1.7的话，整个就2.9
你说的这个1，2，3都是对的。
我之所以想自己搞是因为如果我直接把insert连起来连这个1.2 kb都没有，更小，最精
简的表达单元。而且
minicircle DNA的制备很tricky，条件稍微不合适效率很低。我没有一手经验，这个公
司的人如是说。
【在 j****x 的大作中提到】
: minicircle DNA的“backbone”只有几十bp，就只是两个重组臂的残留序列而已，你说
: 的1.2kb指的是parental plasmid，在最终的mcDNA里面是没有的。
: 线性片段不是不可以，但有几个问题：
: 1. 线性DNA的转染效率会显著低于超螺旋结构的DNA。
: 2. 细胞内的稳定性显著低于超螺旋闭环DNA，因为对DNase更敏感，更容易被降解。
: 3. 缺少稳定的大量制备方法（PCR？）
:
: insert
|
j****x
发帖数: 1704 | 16 这个1.2是包含了全部的表达元件的，包括promoter和polyA，你自己做的话，这些也元
件少不了。当然理论上有可能做到比1.2更小，比如采用更短的promoter/polyA，但是
表达效果就未必能保证了。
mcDNA的制备很tricky没错，但你的线性DNA制备我个人觉得更不稳定。当然，你可以尝
试。我曾经用线性片段建稳转细胞株，效果比质粒强。
systembio.
【在 B***v 的大作中提到】
: 关于minicircle DNA的“backbone”我打电话问这个公司了，https://www.systembio.
: com/，他们说1.2 kbp的backbone，不是parental，我觉得是可以更小的，但他们就这
: 么说的，我的insert 1.7的话，整个就2.9
: 你说的这个1，2，3都是对的。
: 我之所以想自己搞是因为如果我直接把insert连起来连这个1.2 kb都没有，更小，最精
: 简的表达单元。而且
: minicircle DNA的制备很tricky，条件稍微不合适效率很低。我没有一手经验，这个公
: 司的人如是说。
|
B***v
发帖数: 113 | 17 电话里告诉我的：
minicircle without insert 1.2k bp
CMV 350 bp (这个很小，一般600-700bp)
SV40polyA 131 bp（这个也很小）
总觉得这个1.2还包括其他东西。
【在 j****x 的大作中提到】
: 这个1.2是包含了全部的表达元件的，包括promoter和polyA，你自己做的话，这些也元
: 件少不了。当然理论上有可能做到比1.2更小，比如采用更短的promoter/polyA，但是
: 表达效果就未必能保证了。
: mcDNA的制备很tricky没错，但你的线性DNA制备我个人觉得更不稳定。当然，你可以尝
: 试。我曾经用线性片段建稳转细胞株，效果比质粒强。
:
: systembio.
|
j****x
发帖数: 1704 | 18 我自己构建的mcDNA，最终序列除了目的序列表达框，外源的只有不到50bp的重组臂序
列。
至于怎么设计最小化的表达框，就是你自己的事了。
【在 B***v 的大作中提到】
: 电话里告诉我的：
: minicircle without insert 1.2k bp
: CMV 350 bp (这个很小，一般600-700bp)
: SV40polyA 131 bp（这个也很小）
: 总觉得这个1.2还包括其他东西。
|
