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c******i
发帖数: 63 | 2 化学奖也公布了，Crispr今年是没戏了。还好没被打脸。
不过今年汤森路透不给力啊，三大科学奖无一命中。 |
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c******i
发帖数: 63 | 3 以后获奖的概率还是很大的，只是不赞同近期就会获奖的观点。一来，还要进一步观察
Crispr的应用前景；二来，几位发明者都还年轻，等得起。得先把排在前面的老头老太
发了，不然万一哪天他们去世了诺奖委员会又要被骂没眼光了。 |
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g*****n
发帖数: 241 | 4 线虫里面RNAi可以用soaking，比较好奇CRISPR能不能也用soaking呢？谢谢 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 5 大谢！
不记得lentivirus的vector会整合到genome呀。他那个GeCKO v2 vector（包含guide
sequence和Cas9)也能整合进genome吗？
我们有一个自己筛出来的compound，还有一个新的pathway, 所以，想借他的这个思路
，找出这个pathway上的其他蛋白分子。这个思路很不错。
谢谢这里的大侠们。上次来问CRISPR技术,倒是真用这里大侠们提供的方法和思路，作
出了single amino acid的突变（还有几个Nt的突变，引入酶切位点和搞掉PAM，但不改
变amino acid)，连两个拷贝都replace的克隆也拿到很多。这里还真酸生物同行的家。
：）。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 6 你说的是。但没有一个办法可以找到所有可能的原因，就从这个开始。实际上IP也在考
虑之中。因我前面用CRISPR作了点突变，对这个方面熟悉，老板自然就让我往这方面看
看。如果可能，找到几个cadidates,自然就给实验室打开了及格不同的课题，每个学生
可以作一个感兴趣的方向。而我就是打酱油的：没人愿意作或给实验室打基础的
project,往往就是我来承担。当然，工作也轻松一些，常常没有自己的project.：（。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 7 你看我昨天来问的时候就是这个上面有些糊涂。我现在也还担心：如果CRISPR
function很快，virus进细胞后表达gRNA/Cas9，马上ko了一个pathway上的基因，3天的
puromycin selection期间，没整合进genome,这个细胞也可能survive的。所以，我以
为sequencing整个genome来找呢。
既然是比较两个pool,遗漏一些或false positive是难免的。估计搞的几个就好。现在
的signal transduction的“网络”已经很成熟了，找到几个估计就会有谱了。看了
Feng zhang的method section,细胞用量很大，估计是不是考虑了整合进genome的效率
不是很高这个因素。
我这个因是新的pathway,自己有potency到了drug级别的small molecule inhibitor，
所以，就想自己试试。
谢谢！
gRNA |
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p*******1
发帖数: 495 | 9 实验室一直用Unmarked Mutagenesis（using Flp Recombinase）做定点突变，用Tn5做
随机突变。
不知道这几年有什么最新的技术可以采用来创建细菌突变体，CRISPR技术就不用提了。
谢谢了先！ |
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k********n
发帖数: 756 | 10 There are several post-doc and/or senior technician position openings in the
department of neurology at the University of Michigan. The research team is
led by clinical epileptologists.
The research performed uses rats and iPSCs to examine the function epileptic
encephalopathy genes in neurodevelopment and how their mutation lead to
hyperexcitability. CRISPRs, microsurgery, iPSCs, primary cell culture and
cell/molecular biology are platforms to study the gene function in vivo and
in vitro. Thera... 阅读全帖 |
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z*t
发帖数: 863 | 12 非常赞同Lander的第一点和第二点
我个人感觉：套用章良哥的一句话：21世纪是非传统模式生物的世纪。
crispr的发现和NGS的发展使得传统低等模式生物相比于其他生物的遗传清晰，操作方
便的优势变得非常的marginal，以后一定会看到更多更有意思的生物学被发现，而且很
有可能会直接促进我们对自身哺乳动物系统的认知和操作 |
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发帖数: 1 | 14 哈哈，现在就开撕。热闹了 ……
[在 RodinSophie (RodinSophie) 的大作中提到：]
：The Heroes of CRISPR
：
：........... |
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A***u
发帖数: 3714 | 16 Crispr ，NGS，我己经不知道是什么的缩写了。。
我被时间无情的抛弃了。 |
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r********n
发帖数: 164 | 17 快看pubmed commons，真好玩
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=crispr+heroes
Emmanuelle Charpentier2016 Jan 19 5:09 p.m. (23 hours ago) 21 of 21
people found this helpful
I regret that the description of my and collaborators’ contributions is
incomplete and inaccurate. The author did not ask me to check statements
regarding me or my lab. I did not see any part of this paper prior to its
submission by the author. And the journal did not involve me in the review
process.
JENNIFER DOUDNA... 阅读全帖 |
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h*******u
发帖数: 126 | 19 请教各位大牛，我们用CRISPR/CAS9腺病毒敲除基因，在纯化之前的检测PCR和T7EN1有
效果，而用腺病毒纯化试剂盒纯化以后，就不能够切割DNA了？试了两种不同的试剂盒
都是这样，着急死了，怎么回事呢？ 谢谢各位！ |
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c****1
发帖数: 1095 | 20 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
做。
先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
很多。
后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
transfection，通常每个细胞的plasmid会很多，这样Cas9的量太高了，会不会又会增
加off target的概率？
大家一般是首选什么策略？ |
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O*****l
发帖数: 97 | 21 干嘛这么麻烦，用CRISPR质粒 （px330系列）transient表达Cas9和gRNA，同时转两个
，KO效率还是很高的。
如果要做整合，用lenti表达Cas9, 再转入gRNA就是了。不过lenti-Cas9的titer较低，
整合效率不高。 |
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O*****l
发帖数: 97 | 22 共转带Puro／GFP的质粒，用单个Crispr的1:4甚至更少，然后筛选。 |
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b*****s
发帖数: 169 | 23 赞！
搭车问一下，Crispr建立可诱导基因敲除细胞株的protocol在哪有？
谢谢！
geneart- |
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s**2
发帖数: 1287 | 24 很久以前看到有人在版上说做 CRISPR knockin 用单链 RNA 作为模板。
想找来看看，死活找不到了。
麻烦高手指教。谢谢！ |
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K**4
发帖数: 1015 | 25 最近 DNA/RNA editing 火大，赶着劲头 Koonin 也拿了NAS。问题是学术界怎么和演艺
圈一个特点，评价学术也要看流行度，而不是看贡献多少；大家伙也是不做开创性工作
，一个劲的跟风和数杂志。
说到Argonaute，他后面的东西不比CRISPR少，不是有人感兴趣再做分析发现新系统吗
，其实有意思的结果几年前就出来了，有兴趣的人多看看文献。 |
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w********a
发帖数: 324 | 26 关于CRISPR gRNA 的设计，针对细菌的，有好的program可以用来避免脱靶效应吗？
真核的已经有很多程序和软件了，不知道针对细菌的有没有？难道就是自己简单的
BLAST吗？
谢谢！ |
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h**********r
发帖数: 671 | 27 请教楼主一个问题。构建sgRNA表达的时候，是不是转录起点之后尽量少加额外的序列
？我的顾虑是很多启动子的转录起点其实不是特别清楚。在做基因表达的时候，找ATG
就行了。但是不清楚多余的5‘序列对整个Crispr-cas9效率的影响。
我附上了一个简图供参考。多谢！ |
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发帖数: 1 | 28 谢谢
比较好奇，
1.你说的“吹”就是直接在96孔板里用pipette“吹打”吗？
2.等于说直接“吹”就等于代替了trypsin的功能？细胞可以直接detached from
culture dish？
3. 不知道你的这个建议是针对sh-sy5y，还是所有细胞的crispr?
many thanks！ |
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x****6
发帖数: 4339 | 30 这些人是研究crispr/cas9的机制的，属于science;张峰是做工程修改为了应用的，是
engineering
science>>engineering |
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x****6
发帖数: 4339 | 32 重点是他透漏的信息是不是真实的，如果是的话，不管动机如何，还历史以真实，也为
这个领域的健康发展起到一定作用。
从侧面来看，国际上几个颁给crispr/cas9的大奖都没有他和教堂的份，说明了伯克利
和麻省之争的舆论导向。MIT公关再牛逼，干得过世界吗？ |
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x****6
发帖数: 4339 | 33 科学的发展肯定是要借鉴前人的工作，这本身没问题。但是就crispr/cas9的应用来讲
，我个人认为朵得娜的贡献大于张峰，没有她的结构生物学研究，把机制搞清楚，改造
个毛线。 |
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l********7
发帖数: 175 | 34 又看了一下新闻：
Broad Institute, Harvard, and MIT license CRISPR-Cas9 technology to Editas
Medicine for therapeutic applications
说明这次专利转让是George Church，David Liu和Feng Zhang三个组的。 |
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T****i
发帖数: 15191 | 35 没好paper吧？再说CRISPR已经不是高科技了，国内用的挺多了。 |
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发帖数: 1 | 37 有的工作还是需要参考前人经验的，这是科学发展的规律。
同样是gene editing，都是借鉴原核生物里的前人研究，都是in vivo的巨大成功应用
，但是结果却天壤之别。
张锋CRISPR的in vivo system前面有了Doudna的in tube 实验，结果一出来就引起轰动
，拿专利，开公司，顺风顺水。
韩春雨想想，你哥们比我还小啊，凭什么你吃香喝辣，我就坐冷板凳，我也要搞个大新
闻。可是没钱哪，也没有Doudna那个水平，直接上in vivo吧，Ng-Ago一步到位。结果
被一顿群殴，再不敢发声。
所以有时候步子不要迈太大，容易扯着蛋。 |
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发帖数: 1 | 38 不一样的路，CRISPR一开始就不是走造假的路好吧 |
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g********0
发帖数: 6201 | 39 CRISPR一开始走的就是窃idea不算偷的路。 |
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发帖数: 1 | 40 韩春雨做CRISPR，估计又会有诺奖级的发现，Cas9居然能够切protein，还能够切糖。 |
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发帖数: 1 | 41 对于申请经费有前途，个人不是很看好？？
这句话没读懂
意思是申请科研经费有前途
但纵然研究出来的基础成果，对于治病还是没用？
我说的就是研究，因为大量复杂疾病，要么不知道病因；纵然已经知道病因的个体的
phenotype也不同。大量genetic variant都在非编码区无法研究，只能用crispr
那对于疑难杂症，现在的研究热点和手段热点是啥呢
白的 |
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v*******e
发帖数: 11604 | 43 原来是这个，不是crispr吧，“For their description of control theory of
chaotic systems, the OGY method” |
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p*****e
发帖数: 989 | 44 For application of CRISPR-cas9 gene editing in mouse and human cells |
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l*********d
发帖数: 315 | 45 CRISPR是术，不算学。
切割DNA本质上并不解决问题。
举个例子，
一群民工搬砖，一般民工一次搬十块，来个叫CR的民工一次搬一百块，其他民工都觉得
这哥们牛啊，牛魔王的感觉。在地产大佬那里，也就是个民工，分分钟找个更好的，不
缺有力气的，比如Ng阿狗。 |
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f*******d
发帖数: 92 | 46 感谢大哥写这么长这么详细的帖子，真是受益不少。建议版主置顶，所有需要做CRISPR
的新手都应该看看！ |
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m*********D
发帖数: 1727 | 47 希望对你有用。我琢磨了一阵，怎么写容易理解。最后觉得张博士的那篇文章还是基础
，不然读我写的太困难。我也没时间写太长。张博士的文章是我的启蒙，我也就大约读
了前几页，后面的我就不用读了。我也推荐给我们实验室的一个学生作启蒙用。她是边
读边和我讨论，现在也在bench上作了。
CRISPR |
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l*******1
发帖数: 16217 | 48 不，这个确实有用， TALEN已经有治好白血病的例子了，现在中国美国CRISPR都已经进
入一期临床了， 都是用的 ex in vivo 的方法，就是把病人的T cell 提取出来，然后
基因改造， 再放回病人病灶中去， 中美都是target PD-1 增强免疫反应， 美国临床
实验是在MD Adenson Texas, 中国是在四川华西医科大学好像， |
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s***n
发帖数: 678 | 49 TALEN和四川华西医科大学的好像不一样
我说的那几个公司好像不主攻癌症，都是各种各样的病，啥都有，所以我感觉很惊讶，
这CRISPR在哪里都能招呼一锤子么 |
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m**********e
发帖数: 1045 | 50 新子准备用crispr 设计conditional KO, 第一个外显子只有79个核苷酸，如果成功
flox掉，那就将30个信号肰中的26个敲掉了！可能包括前面的UTR一同敲掉！
请问这样设计可以吗？还是从第二个exon开始敲会对避开对promtor的伤害？
谢谢 |
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