s******r
发帖数: 2876 | 1 这说法应该是测试过吧。
今天看医生了
医生显然没听说过YOYO1 因为她马上就开始GOOGLE之
然后找出MSDS之后说其中的有害成分居然是DMSO
MSDS材料说YOYO1本身是NOT AWARE OF ANY TOXICITY
看着这说法应该是没测试过
结合DNA的荧光染料明显可能有毒的啊 居然没测试过
医生说还说没听说过任何癌症有骨关节痛的症状 可是我搜到白血病早期是可以有这种
症状的
然后就查血 抽了两大管 看得我觉得要晕过去了
然后就坐这里在等结果 |
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j******9
发帖数: 180 | 2 会不会是
DNA荧光染料造成DNA DAMAGE(比如错配) =》 DNA REPAIR =》 核酸分解过多=》 嘌呤
代谢障碍 =》 痛风感
不同的人有不同的反应 可能是因为有些人体内酶缺失 所以DNA REPAIR选择的信号通
路不同？ 比如不缺失某种酶的人就不会通过分解错配的DNA来进行修复 所以不会产生
痛感？ |
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R*****o
发帖数: 14902 | 3 quantum dot 可以做spatial分析
子上的荧光均匀性，那位大侠知道？指点一下... |
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c******r
发帖数: 3778 | 5 这个。。。能行吗？荧光基团太大，会不会影响GTP功能啊？ |
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c*****g
发帖数: 408 | 6 没google到，想知道各种荧光基团的size有多少。
想做一些蛋白的移动，但是似乎GFP有时候会影响蛋白转运。请问哪里能找到对各种荧
光基团的介绍？谢谢 |
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b*********2
发帖数: 35 | 7 我记得以前看过confocal的最佳分辨率是 ～0.5 nm。对吗？
这个范围适用于荧光基团的分辨吗？
如果只有一个Cy3标记的RNA，可能用Confocal观察到吗？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 8 关键看你的成像系统的灵敏度和系统的物理稳定性（噪音大小）。
如果是特别特别稳定的系统，一个普通的荧光分子是可以成像的（一个光点）
这个和空间分辨率无关。 |
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b*********2
发帖数: 35 | 9 我用confocal拍的Cy3-siRNA，一直都是红色荧光。 |
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k****n
发帖数: 158 | 10 有没有好的细胞膜荧光染料推荐， 用在live cell imaging 中
谢谢 |
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w*****a
发帖数: 37 | 11 不太想专门买Stratagene's "GlogosII" autorad marker ，又贵，还至少要买100条
，哪用得
了这么多。觉得实在没有必要。实验室也就俩个片盒，但压片没有荧光标记做对照也不
行。。
这里有买过有多余的吗？能送我俩条吗？以前实验室内用得很省，都剪成好几段用。。
多谢了各位，为了这个事愁死了。。 |
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b********h
发帖数: 348 | 13 刚刚发现昨晚做完实验efluro 670 （类似CFSE）的荧光染料落在hood里没有收，还x-
ray照射了一晚上，会不会有影响啊？
efluro 670说明上指示用DMSO 溶解之后要-20度保存，结果我这个室温x-ray几近24小
时照射会不会已经失效啦？ |
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b********h
发帖数: 348 | 14 汇报一下，已经测试过了，荧光丝毫没有受到影响！ |
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l******o
发帖数: 62 | 15 有谁用过荧光2抗做WB, 跟HRP conjugated 的优缺点? |
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e**r
发帖数: 1144 | 16 现在新荧光蛋白太多
去文献里找太麻烦了
有没有一个网上的经常跟新的名录? |
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m******h
发帖数: 32 | 18 各位同仁，我最近在动物细胞中表达一个150的膜蛋白，当在C端加上一个GFP后定位和
功能都正常，然后根据实验需要（FRET），我在GFP之后又加上了一个RFP，中间以一个
50Aa的柔性linker连接。
结果我杯具了：
1，蛋白表达量急剧下降。
2，表达的蛋白都不是去外膜上了，而是trap在各种内膜上，或者说聚集在一起。
但是两个颜色的荧光还都能看见。
目前有点手足无措，不知从何开始改进，各位帮忙给支个招吧，拜谢了！ |
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E*C
发帖数: 1629 | 19 谢谢楼上俩位的回复。
我因为想用FITC标记另一个抗原，结果发现，没标记前就这么亮：（
等下次实验我看看是否是自发荧光。 |
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k***g
发帖数: 4904 | 20 只是普适性的对样品板上存在的细菌（2um左右大小的）进行染色，然后进行显微镜观
察，用什么方法最为方便？有染料可以无差别的对各种细菌进行染色，达到足以显微镜
目测的程度吗？用荧光染色的话，最方便廉价的方法是什么呢？谢谢啦！ |
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b****o
发帖数: 193 | 21 Gram-stain
DAPI
FISH比较麻烦，用细菌通用荧光探针Eu-388. |
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e**r
发帖数: 1144 | 22 用稀释了的染料，还有转染EOSFP的细胞用弱光激活一下
都能看到一些一闪一闪的点，用眼睛也能看到
这些闪烁是单分子的荧光么？ |
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e**r
发帖数: 1144 | 23 查了一下
似乎是可以看到的
还有一个问题
有没有办法区分 single molecule 和 有很多荧光分子的particle ？
没办法通过图像上的亮点的强弱来区分吧？ |
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e**r
发帖数: 1144 | 24 明白了，多谢
还有一个问题，
我显微镜下看荧光分子（据说量子点也一样），看到很多点在闪
这种闪是纯粹由概率造成的么？（也就是说一段时间内，如果一个分子碰巧连续被激活
，看
起来就是亮点，一段时间没撞上激发光，看起来就是暗的）
我google了一下, 看到有的材料说 Blinking 是 由于存在亮／暗两种状态（triplet
blablabla看不懂。。。。）
但我不知道我看到的闪烁是不是就是里面说的这种“blinking” |
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k***g
发帖数: 4904 | 26 先说一下问题背景：没有生物背景的在使用细胞做实验。。所以希望大牛能给我扫盲一
下。。
原来在用Celltracker Orange，$225/1mg, 稀释到5ug/mL使用。似乎working solution
不能储存太长时间，而且最近快用完了，考虑有没有更便宜，操作也简单的染料，替换
这个Celltracker Orange。最好是488nm左右激发的，可以有更多显微镜可以用，不过
别的波长的如果很便宜又好用也可以考虑。做的细菌有革兰氏阳性和阴性的，希望这个
染料就是随便什么细菌都可以染，而且基本保持细胞活性，最好不改变细胞膜状态，而
是钻进膜后固定在细胞内，可以维持一段时间荧光性能。请问有什么染料可以推荐的吗？
多谢多谢了！ |
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a*******a
发帖数: 4233 | 27 CFDA SE可不可以
染细胞一个月没问题，染细菌不知道，说明上好像可以。
488激发 绿色荧光。
solution
吗？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 28 你是说直接突变你手头上的荧光蛋白？可以，没有问题。
只要你不拿去卖，貌似不需要征求同意。 |
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W****7
发帖数: 426 | 29 感谢楼上3位的回复！
我们的肽段是直接在公司合成的，所以比较容易。如果公司可以直接加标记的话我们也
会直接在公司合成的，不会浪费时间在这些小事上。
但是现在的问题就是标记分子的分子量大小，我不不希望分子量太大，否则有可能影响
肽段进入细胞（如果它真的能进细胞的话）。
to ym: 我们应该没有那么高resolution的荧光显微镜，同位素标记的话，不知道怎么
检测它到底能不能进如细胞内。
to 芝麻和小熊：Cys or Lys 也许是好主意，我们的肽段确实有一个Cys，但是具体原
理和操作我需要在查些资料来看看。如果两位有什么推荐的材料的话就更好了！谢谢回
复！ |
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W****7
发帖数: 426 | 30 没有很好的antibody可用。
即使有的话fractionation或者超速梯度离心也不容易区分內源的还是uptake是吧？即
使用无內源表达的细胞系的话WB的灵敏度可能也不如荧光来的高些吧。所以可能还是倾
向于找一种合适的标记物。 |
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W****7
发帖数: 426 | 31 你说的也有道理，我在看看其他的荧光标记吧。
说一千道一万，实验这东西最后还得一个个试，幸运的1,2次就成功了，不幸的时候。
。。。。
不说了，MD谁让我们进这行了，都是眼泪。
总之谢谢所有人的建议，还是很有帮助的，比自己一个人闷头想强多了。 |
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B****r
发帖数: 647 | 32 要读取荧光信号的话，设置的excitation和emission应该不是那个maximum值吧？
要用一个mRFP突变体Q66T，不知道怎么查这两个值，谢谢啦 |
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m******5
发帖数: 1383 | 33 1， 用imagin J设置scale bar for Zeiss observer.A1的各项参数在哪里找？ 很多牌
子的scale bar设置需要的参数在网上都能找到，就Zeiss的找不到
2，小弟用的红色荧光reporter是DsRed，在red channel下看很specific,形态很好，但
问题是在 blue和green channel下看也很明显。
后来问了管理员说这台显微镜的filter 就是不太行，听起来很安慰，但还是很难被
convince，想请教一下这个情况正常么？ (这个DsRed是knock-in到一个endogenous 启
动子下面的所以是弱信号，要不也不会这么纠结了) |
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f*******e
发帖数: 628 | 34 DsRed 的 spectra 看上去 excitation 的确很 broad, 具体取决于你用的显微镜的
blue 和 green 的波段定义，但 DsRed 在一般蓝光绿光 490nm, 515nm 的地方都有不
是太弱的激发，是最大的 40% 和 70%，信号强的话完全可以引起足够观察到的信号。
然后你们那里的荧光显微镜 emission filter 可能用的是 long pass filter, 就是说
，只要 emission 比允许的 wavelength 更长就都能通过。通俗的说就是 DsRed 的红
光 emission 可以通过为了蓝光或者绿光设立的 emission filter (如果是 long pass
而不是 band pass 的话），从而被检测到。如果不是有多个 color 看 correlation
的话，问题不大。 |
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x****u
发帖数: 530 | 35 借宝地搭车问问:
荧光显微镜看GFP标记细胞.转到白光后,显微镜里看到的细胞也是白色背景;但是拍出的
照片,背景却是绿色的,哪位高手能给个高招?
显微镜:Nikon TE200 inverted microscope
光源:白光
拍照软件:snapshot
谢谢啦! |
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s******e
发帖数: 370 | 36 从前用dsRed也碰到过类似问题，当时还兴冲冲的以为co－localization就此做成……
好像现在Tsien实验室已经不建议大家用这个荧光蛋白了，有可能的话换成mCherry？ |
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m***o
发帖数: 77 | 37 谢谢SUNNYDAY。 可是， 如果标上了荧光基团， 那in vivo 的试验还真实吗？ 我是
说， 不管DNA， RNA或蛋白质， 加上一个额外的基团， 它们的生物行为会改变的，
比如， DNA和蛋白质的相互作用，就可能不是真正的相互作用了。 |
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p*l
发帖数: 1359 | 38 理论上讲，只有在大分子上特定的位置上直接加小分子的荧光团，做出来的定位结果才可信。可是这个是不可能in vivo的。in vitro做，蛋白上site specific 加
fluorescent conjugation，据我所知也是很难的事。 |
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a****e
发帖数: 186 | 39 这个讲的不错。
照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。
打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好
，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方
人山人海，就找不着人在哪了。
，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位
置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准
。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两
个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的
中心即使找到了，也没什么意义。也就是说，这种超分辨定位方法，只在每个单分子之
间的间距大于200nm的时候才有用。
位的方法很简单，可是没法直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方
法，能随机把荧光分子来来回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，
他们把大多数分子调到off state，只留下少数分子发光。这样处理之后，就能大体满
足图像内全是互相分得很开的单分子。拍成的... 阅读全帖 |
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v*****s
发帖数: 20290 | 40 只要你运气不是太差，多分子的光团很难恰好也能符合高斯拟合，换句话说，你单分子
的光团理论上讲只有一个亮度中心，其余地方的亮度在极坐标下应该和角度无关，只依
赖于到亮度中心的距离，多分子的光团（特别是两分子，三分子的时候）几乎做不到这
一点，所以去掉这个倒不难。
但我始终对这玩意的原理感到不安，他实质上就是一个deconvolution。你看到的东西
是你的真实信号（假设是dirac function）和你的Instrument response（一个200纳米
的gaussian function）的convolution。那么你把gaussian function从你看到的东西
里面deconvolute掉以后，就是真实信号了。他只不过为了降低deconvolution的难度，
加了一些限制条件（真实信号只是单个dirac function）。
按这个理论，任何仪器的时空精度都可以无限了。我觉得不靠谱的，随便想一下，这个
肯定也要依赖于你的detection system的分辨率有多高，比如你CCD的pixel size是多
少。如果你一个pixel对应过去就是200纳米大小的一个方... 阅读全帖 |
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b******s
发帖数: 1089 | 41 搭车请教一下FCS. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS). 这个是从另外的
角度来研究荧光分子的运动。不追求高分辨率，只是测fluctuations，普通共聚焦就够
了。原理看起来也不复杂，但是在搜集的数据分析阶段看起来很多需要经验，判断哪些
数据不好。而且很多时候得出跟传统方法（比如FRAP)很不一样的结论。很多时候可以
说FCS研究单个分子的波动，FRAP研究一个群体。但是对很多结果还是觉得半信半疑。
有没有高手给讲解一下。谢谢。 |
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b******s
发帖数: 1089 | 42 搭车请教一下FCS. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS). 这个是从另外的
角度来研究荧光分子的运动。不追求高分辨率，只是测fluctuations，普通共聚焦就够
了。原理看起来也不复杂，但是在搜集的数据分析阶段看起来很多需要经验，判断哪些
数据不好。而且很多时候得出跟传统方法（比如FRAP)很不一样的结论。很多时候可以
说FCS研究单个分子的波动，FRAP研究一个群体。但是对很多结果还是觉得半信半疑。
有没有高手给讲解一下。谢谢。 |
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f*******e
发帖数: 628 | 43 ccd camera 是对被 objective 放大之后成像的检测，所以虽然 pixel size 不算太小
，但是算上放大倍数，使得单分子荧光出来的信号不是完全只占一个 pixel 的。基本
上还是能有几个 pixel 产生一个 distribution，这样 deconvolution 就有意义了。 |
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p*l
发帖数: 1359 | 44 所有的super resolution技术，基本思路其实是一样的：既然200nm以内的多
个发光分子无法分辨，我只要能控制这些分子，不让他们全发光就好了。PALM
和STORM用随机switch达到目的，算是比较精巧的法子。Hell的思路比较猛，走
纯物理，用STED来把分子搞得不发光了。所有的super resolution方法中，STED
是最麻烦的，也是唯一不需要任何后期图像处理的，所有的麻烦事都在物理和硬
件上。
一束激发光聚焦到样品上，最理想的情况下，光斑也会有200～300nm直径。通常情况下，整个光斑中的荧光分子都会发光，你说不清楚光是从这个斑里哪部分来的。Hell的想法是，如果让光斑外圈的分子变得不发光了，那么成像分辨率就提高了。做这个只要是非线性的效应就行了，Hell也做过其他方法，但是总的看，还是STED效应最合适。 |
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B*G
发帖数: 13438 | 45 zadehzhong对你第一页上发言的评论没什么问题，你说Sunnyday说的是STED，这个说法
显然是错误的，Sunnyday的最初描述更接近庄的STORM。另外我也没看出zadehzhong关
于分辨率和荧光染色剂的说法有什么错误。这个版面上专业搞成像的人多得是，上面提
到的几个老板组里的人也有，不确定的发言还是要谨慎。
accurate: |
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h****s
发帖数: 401 | 46 Dynamic resolution is different from static resolution.
下，整个光斑中的荧光分子都会发光，你说不清楚光是从这个斑里哪部分来的。Hell的
想法是，如果让光斑外圈的分子变得不发光了，那么成像分辨率就提高了。做这个只要
是非线性的效应就行了，Hell也做过其他方法，但是总的看，还是STED效应最合适。 |
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a*q
发帖数: 2109 | 47 STORM每一帧的采样是Stochastic的，但是最后很多帧的数据加起来得到的图像是完全
Deterministic的，因为是由样品里面的所有荧光标记的位置决定的，所以没有什么问
题啊。
Taekjip Ha做的AFM以及Optical Tweezer跟我们讨论的光学显微完全不是一回事。一个是跟
SAXS一样做提纯分子的研究的，一个是做细胞成像的，而且Taekjip Ha现在也在做
PALM/STORM。
ways:
emphasis
on
microscopy |
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a*q
发帖数: 2109 | 48 CARS的好处确实是不用标记，在临床上最大用处我想应该是做内窥镜和noninvasive的病理学分析；
缺点是灵敏度和特异性不如荧光，所以在细胞生物学上的应用有限，比如做脂肪代谢（谢晓亮发了这方
面的文章的）。 |
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t**********n
发帖数: 283 | 49 Thanks a lot for explaining...
照，成像的分辨率差没关系，只要信号足够亮，定位精确度可以比成像分辨率高很多。
打个比方，我和个朋友约个地方碰头，出门忘了带眼镜，看啥都不太清楚，不过运气好
，碰头的地方就只一个人站在那里，不是我那朋友会是谁。如果运气不好，碰头的地方
人山人海，就找不着人在哪了。
，但是如果事先知道这肯定是个单分子，那么这个模糊光团的中心肯定是这个分子的位
置。这个中心定位的准确性，决定于我拍到的光团的亮度，越亮的光团，中心定位越准
。但是，如果我事先不知道这个光团是从一个单分子来的，这个光团其实是有可能从两
个甚至更多的单分子来的，可能分子之间间距很小，在图像上糊成了一团。那么光团的
中心即使找到了，也没什么意义。也就是说，这种超分辨定位方法，只在每个单分子之
间的间距大于200nm的时候才有用。
位的方法很简单，可是没法直接用在生物成像上。PALM和STORM的创新在于，找到了方
法，能随机把荧光分子来来回回在不发光的状态和发光状态之间调制。每次曝光之前，
他们把大多数分子调到off state，只留下少数分子发光。这样处理之后，就能大... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 50 11th♂的细菌膜蛋白
>时间分辨常数大概在几秒到几十秒量级
那就是说细菌膜蛋白的铁离子通道 如果变化短于几秒 STORM无用武之地了吧?
打个比方用照相机 拍刘翔 百米跨栏的细节 想找到技术弱点 如可能改进后 伦敦奥运夺金牌
用傻瓜机的话是 南柯一梦吧 还得用D700 or MARKII 5D 吧
用电显的电子波长看不明白膜蛋白分子上的亚原子级别的实时动态变化的话
夸克微显系统就有考虑的必要了吧
2014-15
人造太阳可能达到临界点的话
//www.iter.org/fr/accueil
2055 夸克微显系统？
[回复]
[ 117 ]
发信人: abq (NM), 信区: Biology
标 题: Re: 哪位能科普一下ZHUANG的单分子荧光
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Mar 22 00:16:11 2012, 美东)
动态过程还是可以的，时间分辨常数大概在几秒到几十秒量级，跟具体实验参数还有要
看什么东西有关，已经有好几篇文章讲这个的。这方面确实比不上SIM；如果要看的东
西小的话，也比不上STED，不过Commercial的STED太不争气了。 |
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